IL-1β Promoter odaklı DsRed Muhabir Fare kullanma Nötrofil Hazırlama intravital Görüntüleme
Summary
This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.
Abstract
Nötrofiller, insan kan dolaşımında en bol lökositlerdir ve hızlı bir şekilde enflamatuar sitelere alınırlar. Astar nötrofillerin fagositik işlevselliğini artıran önemli bir olaydır. Kapsamlı çalışmalar, H. pylori ve yaralanma içinde mevcut ve nötrofil priming önemini meydana gelmiş olsa da, yok olmuştur, in vivo olarak bu işlemi görselleştirme anlamına gelir. Floresan-konjuge anti-limfosit antijen enjeksiyonu ile elde 2 -) 'de in vivo nötrofil etiketleme emişli bir ölçüsü olarak kullanılır – 1) DsRed reporter sinyalini: Resim protokolü üç yöntemleri birleştirerek yaşayan hayvanlarda priming nötrofil dinamik işlem izlenmesini sağlar 6G (Ly6G) monoklonal antikoru (mAb) ve 3) intravital konfokal görüntüleme. Birkaç kritik adımlar bu protokol katılmaktadırlar: oksazolon kaynaklı fare kulak deri iltihabı, hayvanların uygun sedasyon, anti-Ly6G mAb'nin tekrarlanan enjeksiyonları ve prevgörüntüleme sırasında odak kayması ention. Bir kaç sınırlamalar gibi bir fare sürekli görüntüleme süresi (~ 8 saat) sınırı ve floresein izotiosiyanat-dekstran inflamatuar durumda kan damarlarından sızıntısı olarak, gözlenmemiş olmasına karşın, bu protokolü intravital görüntüleme için temel bir çerçeve sağlar kolayca fare inflamasyon modellerinde diğer bağışıklık hücrelerinin incelenmesi genişletilebilir prime nötrofil davranış ve işlev.
Introduction
Nötrofiller dolaşımda en bol ve kısa ömürlü lökositler bulunmaktadır. Onlar hızla de antimikrobiyal peptidler ve proteazlar 1 içeren granüller ile birlikte reaktif oksijen ve nitrojen ara serbest bırakılması yoluyla profesyonel fagositler hizmet enfeksiyon veya yaralanma sitelerine işe alınırlar. Onların işe sırasında, nötrofiller inflamasyon 2 bir yerinde girişte belirgin gelişmiş fagosit işlevselliği ile sonuçlanan mikrobiyal ürünler, chemoattractants ve inflamatuar sitokinler dahil olmak üzere çeşitli ajanlar tarafından "prime" vardır. Nötrofil hazırlığını mekanizmaları yoğun vitro 3,4 çalışılmıştır; Bununla birlikte, in vivo koşullarında işlemin dinamik kontrolü tarihi mümkün olmamıştır.
Son zamanlarda, intravital görüntüleme görselleştirilmesi ve canlı organizmalarda biyolojik süreçlerin hücresel dinamiklerini miktarının belirlenmesi için önemli bir teknik haline gelmiştir. Intravital görüntüleme geleneksel tek foton uyarma mikroskobu ile (örneğin, konfokal) gerçekleştirilen veya multiphoton mikroskopi 5 yaklaşımlar olabilir. Zamanla, önemli gelişmeler artan görüntü çözünürlüğü, gelişmiş görüntüleme derinliği sağlayan bu teknikle elde edilmiştir, doku fotohasar ve gelişmiş görüntü sabitleme 6,7 azalmıştır. Zamanla hücresel göç ve etkileşim dinamik görselleştirme etkinleştirmek için eşsiz yeteneği göz önüne alındığında, intravital mikroskopi yoğun immünoloji 8 çalışmanın çeşitli alanlarda uygulanmıştır. Intravital görüntüleme daha iyi anlamak ve hayvan modelleri yaşayan hem hücresel ve moleküler düzeyde bağışıklık yanıtlarını contextualize İmmünologlar sağlar.
Son transgenik gelişmeler de knock-in muhabiri fare gibi yaşayan hayvanlarda nötrofil dinamik davranışları izlemek için yararlı araçlar sağlamıştır. Lizozim M organizatörü odaklı gelişmiş yeşil floresan protein knock-infarenin genel ekstravazasyonu, bakteriyel enfeksiyon ve steril bir iltihap 9-15 de dahil olmak üzere çeşitli enflamatuvar süreçlerde nötrofiller, monositler ve makrofajlar hareketliliğini karakterize etmek için kullanılmaktadır. Bundan başka, bir sitoplazmik flüoresan rezonans enerji transferi biyosensör ifade eden transgenik fareler, iltihaplı bağırsak 16 içinde nötrofil hücre dışı düzenlenmiş bir mitojen kinaz ve protein kinaz A aktivitelerini inceleyerek içinde kullanılmaktadır. Nötrofillerde floresans ifadesi için yüksek bir özgüllüğü olan bir fare modeli kendisi lenfosit antijen 6G (Ly6G) 17 sentezlenmesi kuple edilir floresan protein tdTomato, hem de Cre rekombinazı üreten Catchup knock-in fare,. Bu modelde aracılığıyla Ly6G eksikliği nötrofil Görselleştirme bu hücrelerin steril ya da bulaşıcı in vivo enflamatuar bağlamlarda çeşitli normal işlevlerini uygulamak olduğunu göstermiştir. DsRed flüoresan s ifade eden transjenik fareninnötrofiller, iltihabik monositler ve aktive makrofajlar içerdiğine inanılmaktadır – – (IL-1β) promoteri (pIL1-DsRed), IL-1β üreten hücrelerin hareketsiz davranışları görselleştirmek için kullanılmıştır interleuikin-1 p fare kontrolü altında genin rotein çıkan iltihaplı cilt 18.
İn vivo markalama iltihaplı dokuların nötrofil hücresel ve moleküler davranışları izlemek için alternatif bir yaklaşım olarak görev yapabilir. Anti-Gr-1 monoklonal antikoru (mAb) floresan etiketli düşük dozlarda intravenöz enjeksiyon, Gr-1 + nötrofillerin ilerlemesini kaskad sonra Staphylococcus aureus 19 ile enfekte edilmiş farenin deri lezyonlarında görselleştirilmiştir. Streptavidin içeren konjugatlarının in vivo uygulama konjuge 705 nm kuantum noktaları ve biyotinile anti-Ly6G mAb özellikle dolaşan nötrofillerin 20 etiket. neutroph bu tür konjugatların Ayrıca, endositozIL veziküller interstisyuma göç nötrofillerde yüksek hızlı vezikül taşıma izleme sağlar. in vivo P-selektin karşı floresans-konjuge antikor Branşman integrin ligand-1 (PSGL-1), L-selektin (CD62L) glikoproteini ile markalama (CD11b bir TNFa kaynaklı inflamatuar modelinde) ve kemokin (CXC motifi) reseptör 2 (CXCR2) erken inflamasyon 21 döneminde oynayan düzenleyici mekanizmalar açığa çıkartılmıştır. Polarize nötrofiller CD11b ve CXCR2, nötrofil göçünü sürücü ve inflamasyonu başlatan reseptörlerinin dağıtılması sonuçlanan aktive trombositler üzerinde CD62L mevcut ile etkileşim uropods PSGL-1-zenginleştirilmiş çıkıntı.
IL-1β hazırlanmış nötrofillerin 22 yükselir imza genlerin biridir. PIL1-DsRed muhabiri farelerde, DsRed floresan sinyalleri (yani., IL-1β promotörünün aktivasyonu) olumlu mRNA ifadesi ve IL-1β protein üretimi, IL-1β ile bağlantılıdır. <sup> 18 nötrofil astarlama işlemi izlemek için, intravital mikroskopik bir yöntemi floresans konjuge edilmiş anti-Ly6G mAb ile nötrofillerin in vivo etiketlemeden sonra pIL1-DsRed fare modelinde oksazolon (OX) deri iltihabı indüksiyonu dahil geliştirilmiştir. Bu model ile, çeşitli hastalıkların ve rahatsızlıkların hayvan modellerinde astar nötrofillerin davranış ve işlevini incelemek mümkündür.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmanın amacı, henüz mevcut tekniklerle yerine olmamıştır yaşayan hayvanların, nötrofil astarlama işlemi izlenmesi için bir teknoloji geliştirmektir. Bu amaca ulaşmak için, üç kurulan yöntemler gerçekleştirilir: deri iltihabı 1) İndüksiyon, IL-1β promotör-tahrikli DsRed raportör farelerde astarlama bir ölçüsü, flüoresan-konjuge anti-Ly6G düşük doz nötrofillerin 2) in vivo olarak etiketleme mAb, ve 3) intravital konfokal mikroskopi görüntüleme. Bu üç yöntemin komb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 Kda | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
- Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
- Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).
- El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).
- Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. Cellular imaging in rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).
- Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues. Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).
- Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. The future of immunoimaging–deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).
- Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF. J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).
- Chen, X., et al. In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression. J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).
- Slaba, I., et al. Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice. Hepatology. , (2015).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Matsushima, H., et al. Intravital imaging of IL-1beta production in skin. J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci. Rep. 3, (1913).
- Sreeramkumar, V., et al. Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation. Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).
- Yao, Y., et al. Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation. J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice). Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration). Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
- Mizumoto, N., et al. Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening. Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).
- Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound. Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).
- Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes. Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).
- Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice. Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).
- Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation. Blood. 100 (3), 854-861 (2002).
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).
- Zucker, R. M. Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability. Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).
- Hogan, H. Focusing on the experiment. Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).
- Kabashima, K., Egawa, G. Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses. J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).
- Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy. J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
