Intravital Imaging von Neutrophilen Priming Mit IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mäuse

Summary

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Abstract

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommenden Leukozyten im menschlichen Blutkreislauf und sind an Entzündungsstellen schnell rekrutiert. Priming ist ein kritisches Ereignis, das die phagozytischen Funktionalität von Neutrophilen erhöht. Obwohl umfangreiche Studien die Existenz und die Bedeutung der neutrophilen Priming während der Infektion und Verletzungen enthüllt haben, bedeutet , diesen Prozess der Visualisierung in vivo nicht erreichbar gewesen. Das Protokoll bereitgestellt wird, ermöglicht die Überwachung des dynamischen Prozesses der Neutrophilen in lebenden Tieren Priming durch drei Methoden kombinieren: 1) Signal DsRed reporter – verwendet als ein Maß für Priming 2) in vivo – Markierung von Neutrophilen – erreicht durch Injektion von Fluoreszenz-konjugiertem anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoklonaler Antikörper (mAb) und 3) intravital konfokale Bildgebung. Oxazolon-induzierte Mausohr Hautentzündung, geeignete Sedierung von Tieren, wiederholte Injektionen von anti-Ly6G mAb und zurück: Mehrere wichtige Schritte sind in diesem Protokoll beteiligtention der Fokusdrift während der Bildgebung. Obwohl einige Einschränkungen beobachtet, wie die Grenze der kontinuierlichen Bilderzeugungszeit (~ 8 h) in eine Maus und das Austreten von Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran aus den Blutgefäßen in der Entzündungszustand liefert dieses Protokoll ein Grundrahmen für die intravital Abbilden grundierten Neutrophilen Verhalten und Funktion, die zur Prüfung von anderen Immunzellen in der Maus Entzündungsmodellen leicht erweitert werden kann.

Introduction

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommenden und kurzlebig Leukozyten im Umlauf. Sie sind schnell zu den Standorten der Infektion oder Verletzung rekrutiert, wo sie als professionelle Phagozyten durch Freisetzung von reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffzwischenprodukte zusammen mit Granulat enthält , um antimikrobielle Peptide und Proteasen ¹ dienen. Während ihrer Rekrutierung, sind Neutrophile "grundiert" durch verschiedene Mittel , einschließlich mikrobielle Produkte, Lockstoffe, und inflammatorischen Zytokinen, was zu einer deutlich verbesserten Phagozyten Funktionalität bei der Ankunft an einem Ort der Entzündung ^2. Die Mechanismen von Neutrophilen Priming extensiv wurden in vitro untersucht ^3,4; jedoch dynamische Überwachung des Prozesses in vivo ist bisher nicht möglich gewesen.

Vor kurzem hat intravital Bildgebung eine wichtige Technik zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Dynamik von biologischen Prozessen in lebenden Organismen werden. Intravital Bildgebung kann über herkömmliche Einphotonenanregung Mikroskopie (zB konfokale) oder Multiphotonen – Mikroskopie Ansätze ⁵ durchgeführt werden. Im Laufe der Zeit wurden in dieser Technik erzielt deutliche Verbesserungen erhöhte Bildauflösung ermöglicht, eine verbesserte Bildtiefe, verringerte Gewebelichtschäden und eine verbesserte Bildstabilisierung ^6,7. Aufgrund seiner einzigartigen Fähigkeit , dynamische Visualisierung von Zellmigration und Interaktion im Laufe der Zeit zu ermöglichen, hat Intravitalmikroskopie wurde ⁸ verschiedenen Bereichen der Studie in der Immunologie ausgiebig angewendet. Intravital Imaging ermöglicht Immunologen besser zu verstehen und in lebenden Tiermodellen Immunreaktionen sowohl auf zellulärer und molekularer Ebene zu kontextualisieren.

Jüngste Fortschritte in der transgenen sowie Knock-in-Reporter Mäusen haben nützliche Tools zur Verfügung gestellt, die dynamischen Verhalten von Neutrophilen in lebenden Tieren, die für die Überwachung. Lysozym M Promotor getriebene Enhanced Green Fluorescent Protein Knock-inMäuse wurden Motilität von Neutrophilen, Monozyten zu charakterisieren und Makrophagen während verschiedener Entzündungsprozessen einschließlich Extravasation, bakterielle Infektion und sterile Entzündung ^9-15 breit verwendet. Ferner wurden bei der Untersuchung der Aktivitäten der Neutrophilen extrazellulären regulierten Mitogen – Kinase und Proteinkinase A im entzündeten Darm ¹⁶ eingesetzten transgenen Mäusen eine zytoplasmatische Fluoreszenz – Resonanz – Energie – Transfer – Biosensor zum Ausdruck. Ein Mausmodell mit hoher Spezifität für die Fluoreszenz die Expression in Neutrophilen ist die Catchup Knock-in – Maus, die wie auch das fluoreszierende Protein tdTomato Cre – Rekombinase produziert, die sich zur Expression von lymphocyte antigen 6G (Ly6G) ¹⁷ gekoppelt ist. Visualisierung von Ly6G-defizienten Neutrophile über diesem Modell hat gezeigt , dass diese Zellen normale Funktionalität in einer Vielzahl von sterilen oder infektiösen in vivo Entzündungs ​​Kontexten ausüben. Transgene Mäuse, die DsRed fluoreszierende p ausdrückenrotein Gen unter der Kontrolle des Maus-interleuikin-1β (IL-1β) -Promotor (Pil1-DsRed) verwendet wurden, um die motile Verhalten von IL-1β produzierenden Zellen sichtbar zu machen – angenommen Neutrophile, inflammatorische Monozyten einschließen und aktivierte Makrophagen – Schwellen in entzündeter Haut ^18.

In vivo als Alternative dienen zur Verfolgung der zellulären und molekularen Verhalten von Neutrophilen in entzündeten Geweben Markierung kann. Nach intravenöser Injektion von niedrigen Dosen von fluoreszenzmarkierten anti-Gr-1 monoklonalen Antikörpers (mAb), die Rekrutierung Kaskade von Gr-1 ⁺ Neutrophilen in Maushautläsionen infiziert mit Staphylococcus aureus ^19. In – vivo – Verabreichung von Konjugaten wurde enthaltend visualisiert Streptavidin- konjugiertes 705 nm quantum dots und biotinyliertes anti-Ly6G mAb spezifisch etikettieren zirkulierende Neutrophile ^20. Darüber hinaus Endozytose solcher Konjugate in neutrophil Vesikel ermöglicht Verfolgung von Transporthochgeschwindigkeits Vesikel in Neutrophilen in das Interstitium migrieren. In vivo Markierung mit Fluoreszenz-konjugierte Antikörper gegen P-Selektin – Glykoprotein – Ligand-1 (PSGL-1), L-Selectin (CD62L), Integrin & agr; M (CD11b ) und Chemokin (CXC – Motiv) Rezeptor 2 (CXCR2) in einem TNF-induzierten Entzündungsmodell wurde während der frühen Entzündung ²¹ die Regulationsmechanismen im Spiel erläutert. Polarisiert Neutrophilen herausragen PSGL-1 angereicherte Uropoden mit CD62L sich auf aktivierten Blutplättchen zu interagieren, was bei der Umverteilung von CD11b und CXCR2, Rezeptoren, die die Migration von Neutrophilen treiben und initiieren die Entzündung.

IL-1β ist eines der Gene , die Signatur ²² in grundierten Neutrophilen erhöht ist. In Pil1-DsRed Reporter – Mäuse, DsRed Fluoreszenzsignale (dh., Die Aktivierung von IL-1β – Promotor) positiv mit IL-1β – mRNA – Expression und IL-1β Protein – Produktion korrelieren. <sup> 18 Zur Überwachung wurde der Prozess der Neutrophilen – Grundierung, ein Intravitalmikroskopie – Verfahren mit Oxazolon (OX) beteiligt Induktion von Hautentzündung entwickelt im Pil1-DsRed Mausmodell folgende in vivo – Markierung von Neutrophilen mit Fluoreszenz-konjugierten anti-Ly6G mAb. Über dieses Modell ist es möglich, das Verhalten und die Funktion der neutrophilen Granulozyten grundiert in Tiermodellen von verschiedenen Krankheiten und Störungen zu untersuchen.

Protocol

Alle Tierversuche sind in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien und genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Toledo durchgeführt. 1. Phänotypisierung von Pil1-DsRed Mäuse HINWEIS: Nachkommen werden von der Zucht heterozygot Pil1-DsRed Mäuse mit Wildtyp (WT) C57BL6 Mäuse erzeugt. Drei bis vier Wochen alte Welpen werden als bereit für die Phänotypisierung. Submandibular Blutung der Mäuse folgt…

Representative Results

Screening von Pil1-DsRed-Mäusen basiert auf der phänotypischen DsRed Fluoreszenzsignal durch ihre peripheren Blutleukozyten mittels Durchflusszytometrie durchgeführt produziert. LPS – Stimulation bekannt ist IL-1β – Produktion in myeloischen Zellen , einschließlich Neutrophile, Monozyten und dendritischen Zellen 26-28 induzieren. Somit werden isolierte Leukozyten 4 h mit LPS inkubiert vor der Zytometrie Analyse fließen. Myeloischen Zellen für die Zirkulation auf Basis v…

Discussion

Das Ziel dieser Studie ist es, eine Technologie zur Überwachung des Prozesses der Neutrophilen-Priming in lebenden Tieren zu entwickeln, die noch nicht von den derzeit verfügbaren Techniken erfüllt. Um dieses Ziel zu erreichen, drei etablierten Methoden durchgeführt werden : 1) Induktion von Hautentzündung in IL-1β Promotor getriebene DsRed Reportermäusen als Maß für die Grundierung, 2) in vivo – Markierung von Neutrophilen mit niedrigen Dosen von Fluoreszenz-konjugiertem anti-Ly6G mAb und 3) intravita…

Materials

Heparin sodium	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-540-31
ACK lysing buffer	Lonza	10-548E
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F0926
Lipopolysaccharides	Sigma-Aldrich	L4391
Ketamine hydrochloride	Hospira	NDC 0409-2051-05
Xylazine	LLOYD Laboratory	NADA #139-236
Acepromazine	Boehringer Ingelheim	ANADA 200-361
Hair-removal cream	Church & Dwight
Acetone	Fisher Scientific	A16P4
Oxazolone	Sigma-Aldrich	E0753
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody	BioLegend	127610
U-100 insulin syringe with 28 G needle	BD	329461
FITC-CM-Dextran, 150 Kda	Sigma-Aldrich	74817
Butterfly infusion set (27 G needle)	BD	387312
FACSCalibur cytometer	BD
CellQuest Pro software	BD
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Metamorph Software	Universal Imaging