Introduction
Måling af elektroretinogrammet (ERG) og visuelt fremkaldt potentiale (VEP) give nyttige kvantitative vurderinger af integriteten af den visuelle pathway. ERG måler de elektriske reaktioner i nethinden for lys stimulation, mens VEP måler den tilsvarende funktionelle integritet af de visuelle veje fra nethinden til den primære visuelle cortex efter samme lys begivenhed. Dette håndskrift beskriver en protokol til registrering og analyse af ERG og VEP reaktioner i et almindeligt anvendt laboratorium model, rotten.
ERG tilvejebringer et indeks for den funktionelle integritet en række centrale retinale celle klasser ved at kvantificere retinas brutto elektriske reaktion på et lysglimt. En koordineret række ioniske fluxer initieret ved påbegyndelse af lys og offset, producerer påviselige ændringer i spænding, der kan måles under anvendelse af overfladeelektroder anbragt uden for øjet. Den resulterende bølgeform repræsenterer kombinationen af en seRies af veldefinerede komponenter, forskellige i amplitude, timing og frekvens. En betydelig mængde forskning har vist, at disse komponenter er forholdsvis velbevarede tværs mange hvirveldyr retinae og at komponenterne kan adskilles fra hinanden. Ved velovervejet valg af stimulus (flash stimulus, baggrund, interstimulus interval) betingelser og vælge specifikke træk ved det sammensatte bølgeform for at analysere, kan man være sikker på at returnere et mål for en specifik gruppe af retinale celler 1,2. Disse karakteristika ligger til grund for nytte og dermed udbredte anvendelser af ERG som en ikke-invasiv måling af retina-funktion. Dette håndskrift fokuserer på metode til måling af ERG og analysere dens funktioner til at returnere information om nogle af de store celle klasser i nethinden, nemlig fotoreceptorer (den PIII komponent), bipolære celler (PIO komponent) og retinale ganglieceller (den positive scotopic tærskel respons eller pSTR).
3. Hos gnavere størstedelen (90 - 95%) af optiske nervefibre fra hvert øje decussate 4 og innerverer den kontralaterale midten af hjernen. I modsætning til ERG, er det hidtil ikke muligt at tilskrive forskellige komponenter i VEP til specifikke celle klasser, 5 ændrer således overalt langs den visuelle pathway kan påvirke VEP bølgeform. Ikke desto mindre er VEP er en nyttig ikke-invasiv måling af visuel ydeevne og visuel pathway integritet. VEP, når den anvendes sammen med ERG, kan tilvejebringe en mere fuldstændig vurdering af det visuelle system (dvs. retina / visuelle pathway).
ERG og VEP optagelser kan udføres isoleret eller i kombination, afhængig af ansøgkation. Den i dette dokument metodik muliggør samtidig evaluering af retinal og kortikal visuelt fremkaldt elektrofysiologi fra begge øjne og begge halvkugler i bedøvede rotter. Dette er en nyttig måde at mere omfattende vurdering retinal funktion og opstrøms effekter, som ændringer i nethindens funktion kan have på visuelt fremkaldt kortikal funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med den australske adfærdskodeks for pasning og anvendelse af dyr til videnskabelige formål, der er fastsat af National Health og Medical Research Council i Australien. Etik clearance blev opnået fra University of Melbourne, Science Fakultet, Animal Ethics Committee (autorisationsnummer 0.911.322,1).
1. Pre-implantation af kronisk VEP elektroder
Bemærk: Hvis samtidige ERG og VEP signaler indsamles dyr skal kirurgisk implanteret med VEP elektroder mindst 1 uge før signalere samling.
- Sterilisere den kirurgiske bænk før eksperimentering ved at rense med chlorhexidin (0,5% i 70% ethanol). Autoklavér alt kirurgisk udstyr før brug. Dæk dyret med en steriliseret kirurgisk afdækningsstykke. Sørg for at alle eksperimentatorer bære kirurgiske masker, kjoler og steriliserede handsker.
- Narkosen med 3 - 3,5% isofluran med O 2 ved en strømningshastighed på 3 l / min. Vedligehold anesthesia ved 1,5% og 2 l / min gennem hele operationen. Sikre tilstrækkelig dybde af anæstesi ved fraværet af paw pinch refleks.
- Påfør 1% natriumcarboxymethylcellulose på hornhinden for at forhindre udtørring af øjnene.
- Barbering en 30 mm x 30 mm området over panden, posterior for øjnene og forreste til ørerne.
- Placer dyr på en varmepude (37 ˚C) for at opretholde kroppens temperatur og stabilisere dyrenes hoved med en stereotaktisk ramme.
- Desinficer det barberede område med 10% povidon-jod tre gange. Undgå at bruge alkohol-baserede antiseptiske for området nær øjet, være i overensstemmelse med standarden for god praksis fastlagt af Sammenslutningen af kirurgiske teknologer.
- Lav en median-sagittale snit på hovedet med en skalpel og fra cirkel denne punktafgifter en ~ 20 mm diameter dermal væv at eksponere kraniel knogle.
- Fjern underliggende periosteum ved skrabning og tørring med gaze for at afsløre de koronale og sagittale kranielle suturer.
- Osing en dental krog fastgjort til et bor, trepan to huller (mm diameter 0,7, dybde ~ 1 mm) gennem kraniet på begge halvkugler på stereotaktisk koordinater: 7 mm kaudalt for bregma, 3 mm lateralt til midtlinien.
- Skrue i rustfri stålskruer (diameter 0,7 mm, længde 3 mm, steriliseret med chlorhexidin) i de to præfremstillede huller op til en dybde på ~ 1 mm (2 mm af skruen blotlagt) for at tillade fast forankring. This kontakter dura uden at beskadige det underliggende cortexvæv.
- Forbered kirurgisk område for dental amalgam ved tørring af kranie knogle med gaze, og trække løs hud med to 3 - 0 suturer på ~ 4 og 8:00.
- Spred dental amalgam over udsatte kraniet for at sikre skruen elektroder (rustfrit stål skruer, der er beskrevet i trin 1.10) på plads. Sørg ~ 1,5 mm skruerne forbliver udsat til optagelse.
- Fjern tilbagetrækningsaksen suturer.
- Injicer 0,5% carprofen subkutant (5 mg / kg) for analgesi og saltvand (0,9% natriumchlorid, 10,5 ml) subkutant til væske udskiftning.
- Tillad dyret kan komme i separate bure. Efterlad ikke dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje.
- Må ikke vende tilbage dyr til selskab med andre dyr, indtil den er fuldt tilbagebetalt fra kirurgi (minimum 5 dage).
- Fortsæt med at administrere 0,5% carprofen subkutant for analgesi (5 mg / kg) en gang om dagen i 4 dage.
- Optag ERG og VEP 1 uge efter operation.
2. ERG og VEP Recording
- forberedelse Dataindsamling
- Brug software til samtidig udløse stimulus og erhverve data 2 i henhold til indstillingerne anbefalede nedenfor.
- Forstærke signalerne 3 (ERG: × 1000, VEP: 10.000 gange) med forstærkningen internt fastsat af en isoleret forforstærker og forstærker, og med begge øjne matchede til impedans.
- Indstil sampling sats for ERG til 4 kHz over en 650msek indspilning vindue (2.560 point), at gøre dette, skal du klikke på fanen for "tid base" i datafangst software (for navn og version på software Se tabel for Materials), skal du vælge "2560" for prøver, og "500 ms" for tiden, som vil returnere en 650 msek optagelse vindue.
- Brug den samme metode til at vælge samplingfrekvens for VEP til 10 kHz over en 250 msek epoke. Tillad en 10 msek pre-stimulus baseline for både ERG og VEP optagelser. For at gøre dette, klik på fanen "Setup"; vælg "Stimulator" for at opdrage et nyt vindue dialog; i dette vindue skal du vælge "puls" fra drop down listen for "Mode"; og indstil værdien for "forsinkelse" til "10 ms".
- Set ERG band-pass filtrering til 0,3 - 1.000 Hz (- 3 dB). Dette gøres ved at klikke på "Bio forstærker" i datafangst software. Derefter indstille værdien for "High Pass" til "0.3Hz", og værdien for "low pass" til "1 kHz".
- Brug ovennævnte metode i 2.1.1.3, sæt VEP band-pass-indstillinger til 0,1 - 100 Hz, (- 3 dB) som anbefalet af Den Internationale Selskab for Klinisk Elektrofysiologi af Vision (ISCEV) for menneskers VEP optagelser 6.
- Brug software til samtidig udløse stimulus og erhverve data 2 i henhold til indstillingerne anbefalede nedenfor.
- forberedelse Elektrode
- Brugerdefineret-gøre ERG aktive / inaktive og VEP aktive / inaktive elektroder ved at knytte sølvtråd eller en alligator klip til en elektrode bly, henholdsvis 2. Kommercielt få jordelektrode.
- For de 4 specialfremstillede elektroder, sender han-ende fra elektroden bly forlængelse. Fjern 1 cm af den ydre polytetrafluorethylen isolering belægning med en skalpel sikre den indre ledning ikke er beskadiget.
- Pre-mode ERG inaktive elektroder ved at skære en 70 mm længde sølvtråd (0,3 mm tykkelse) og danner en løkke ~ 8 mm i diameter for at omringe rotteøjet. Forbered en ensartet cirkel ved at forme løkken på en 1 ml pipettespids.
- Pre-mode ERG-aktive elektroder ved at skære en 30 mm længde af sølvtråd og danner en lille løkke til forsigtigt kontakte hornhinden i rotter (~ 1-2 mm i diameter)
- Fastgør elektroder (2 ERG aktiv, 2 ERG inaktiv, en VEP inaktiv) til elektroden ledet af blander fornemt af sølv med den blotlagte indre ledning.
- Isoler overskydende udsatte metal med malertape til at reducere fotovoltaiske artefakter.
- På ERG inaktive elektroder stick et lille stykke af krog- og løkkefastgørelsesorgan (~ 5 mm x 20 mm) til afdækningstape at muliggøre stabil fastgørelse til gnaver halsrem.
- Vedhæfte krokodillenæb til den indre ledning af elektroden fører til lave VEP aktive elektroder.
- Forud for optagelserne, elektroplettere de udsatte overflader af sølv ledninger (dvs. den inaktive ring og aktive tip) med chlorid med et 9 V DC kilde til 20 sek for at forbedre signal ledning.
- For at gøre dette, fordybe sølvspidsen af ERG elektrode wire (fungerer som anode af en primær celle) i normalt saltvand; tilslut den anden ende af denne elektrode ledning til den positive terminal af et 9 V batteri.
- Tilslut en anden ledning (katoden) til den negative terminal på batteriet, og fordybe den anden ende i saltvand så godt. Afbryd efter 20 sek og observere splint spidsen af ERG elektrode wire, der skal belægges jævnt i hvid farve.
Bemærk: Der laves nye ERG elektroder for hver eksperimentel session (~ op til 8 timer) for at sikre åbenheden af chlorid belægning.
- forberedelse Animal
- Dark-tilpasse dyrene natten over (≥ 8 HR) forud for optagelser i et lystæt rum. Sikre maksimal mørk tilpasning ved at slukke værelse lys, lukke alle døre og persienner. Minimere lysudslip ved at placere lys-bevis materialer omkringkryds af døre / vinduer og placering computerskærme uden tykke sorte gardiner.
- Gennemføre forberedelse dyr i et mørkt rum ved hjælp af svagt rødt lys-dioder (LED; 17,4 cd.m -2, λ max = 600 nm) til at opretholde stang følsomhed.
- Bedøver rotte ved at injicere ketamin / xylazin (60: 5 mg / kg) intramuskulært. Bekræft tilstrækkelig dybde af anæstesi ved fraværet af en pote knivspids refleks.
- For at opretholde sedation, administrere en yderligere dosis af anæstesi (50% af initial dosis) efter 50 min om nødvendigt.
- For yderligere aktuelt anæstesi anvende en dråbe 0,5% proxymetacaine til hvert øje, og blinker overskydende væske.
- For udvidelse af pupillerne anvende en dråbe 0,5% tropicamid til hvert øje, så tørre overskydende væske.
- ERG og VEP elektrode positionering
- Placer dyr på ERG-platformen foran Ganzfeld skålen beliggende i Faradays bur. Undgå at bruge en elektrisk varmepude, som det cen indføre elektrisk støj ind i de elektrofysiologiske optagelser. Bemærk: Platformen er fastgjort til en cirkuleret opvarmet vand platform for at opretholde legemstemperatur.
- Sikker dyr til platform med en strimmel af krog-og-løkke fikseringsorgan anbragt fast, men ikke stramt omkring nakken.
- Hook den inaktive VEP elektroden omkring bunden fortænder af bedøvet rotte.
- Anbring ERG inaktive elektroder ved omkranser sclerale ring på ikke-indtrængende omkring øjets ækvator. Stabiliser dette ved at fastgøre elektroder til hook-and-loop fastener strimmel rundt om nakken. Gentag for den kontralaterale øje.
- Fastgør VEP aktive elektroder ved at knytte krokodillenæb til rustfrit stål skruer pre-implanteret på kraniet.
- Placer en lille dråbe 1% natriumcarboxymethylcellulose på hornhinden før placering af ERG aktive elektrode for at forbedre signalkvaliteten. Bemærk: Den viskose væske hjælper også opretholde hornhinde hydrering hele eksperimenter til miniMize dannelsen af udtørring type grå stær hos gnavere 7.
- Placer en lille dråbe 1% carboxymethylcellulosenatrium på de nedre fortænder til at forbedre kontakten af VEP inaktive elektrode og dermed signalkvalitet.
- Anbring ERG aktive elektroder lige rører den centrale hornhinde overfladen med en mikromanipulator knyttet til en specialbygget stereotaktisk arm.
- Sæt 2 - 5 mm af jorden nål elektrode (rustfrit stål) subkutant i halen.
- Hvis det er nødvendigt at tørre overskydende væske fra ringere øjenlåget før optagelse for at forbedre signalkvaliteten.
- Slide platform tættere på Ganzfeld skålen sikre dyrets øjne flugte med åbningen af skålen for at muliggøre jævn belysning af begge nethinder (se trin 2.4.1).
- Luk Faraday bur for at reducere uvedkommende støj.
- Dataindsamling
- Brug en dim test-flash (- 0,52 log cd.sm -2) for at vurdere, om elektroden placement er tilfredsstillende 2. Under kontrol betingelser vil dette resultere i en ERG amplitude på ~ 800 μV og en inter-eye variabilitet ikke større end 10%. Hvis der kræves repositionere elektroder.
- Efter testen flash tillade, at dyr til mørk-tilpasse i 10 minutter i komplet mørke før optagelsen.
- Nuværende lysglimt stimuli ved hjælp af en Ganzfeld skål mens indsamle ERG og VEP signalerer samtidigt over en ~ 500 ms tid-vindue. Fremskridt fra lysdæmper til lysere lys niveauer for at opretholde en tilstrækkelig dark-tilpasning til særlige kurver.
- Indsamle signaler over et område af lysende energi til at fremkalde STR, b-bølge og a / b-bølge bølgeformer af ERG. Gennemsnitlige flere signaler ved de svagere lysniveauer (20 gentagelser) og mindre på de lysere lysende energier (1 rapport). Gradvist forlænge den inter-stimulus interval 1-180 sek fra dimmest til den lyseste lysniveau. Se tabel 1 for et eksempel protokol.
- Til isosent ERG-stang og kegle reaktioner, udnytte en parret-flash paradigme 8. Indled fire blink på 1,52 log cd.sm -2 med en 500 ms inter-stimulus interval 2 i-mellem. Digitalt trække kegle bølgeform (3. eller 4. blitz) fra den blandede bølgeform (1. blitz) at udlede den formodede stang respons.
- Hvis du vil optage VEP signaler gennemsnit 20 gentagelser på lysere lysende energier (dvs. - 0,52-1,52 log cd.sm -2, 5 sek inter-stimulus interval). Bemærk, at den første flash i denne sekvens returnerer den konventionelle mørke tilpasset ERG respons.
- Tillad 1 - 3 ud min for re-tilpasning efter (20) VEP fejer inden næste lysere ERG trin, afhængigt af lysenergi.
- Efter afslutningen af dataindsamlingen, aflive den bedøvet dyr med intrakardial injektion af pentobarbital natrium (325 mg / ml, 3 ml).
| Waveform | Stimulus lysenergi (log cd.sm -2) | Antal gentagelser | interstimulus interval (sek) |
| STR | -6,24 | 20 | 2 |
| STR | -5,93 | 20 | 2 |
| STR | -5,6 | 20 | 2 |
| STR | -5,33 | 20 | 2 |
| Rod b-bølge | -4,99 | 10 | 2 |
| Rod b-bølge | -4,55 | 10 | 2 |
| Rod b-bølge | -4,06 | 5 | 5 |
| Rod b-bølge | -3,51 | 5 | 5 |
| Rod b-bølge | -3,03 | 1 | 15 |
| Rod b-bølge | -2,6 | 1 | 15 |
| Rod b-bølge | -1,98 | 1 | 15 |
| Blandet a- / b-bølge | -1,38 | 1 | 30 |
| Blandet a- / b-bølge | -0,94 | 1 | 30 |
| Flash 1: Blandet a- / b-bølge Gennemsnit af 20: VEP | -0,52 | 20 | 5 |
| (90 sek før næste) | |||
| Flash 1: Blandet a- / b-bølge Gennemsnit af 20: VEP | 0,04 | 20 | 5 |
| (120 sek før næste) | |||
| Flash 1: Blandet a- / b-bølge Gennemsnit af 20: VEP | 0,58 | 20 | 5 |
| (180 sek før næste) | |||
| flash 1: Blandet a- / b-bølge Gennemsnit af 20: VEP | 1.2 | 20 | 5 |
| (180 sek før næste) | |||
| Flash 1: Blandet a- / b-bølge Gennemsnit af 20: VEP | 1,52 | 20 | 5 |
| (180 sek før næste) | |||
| Cone a- / b-bølge | 1,52 | 4 | 0.5 |
Tabel 1. ERG og VEP Recording protokol Ved hjælp af en vifte af Stimulus Energi. Stimulus præsentationer fremskridt fra dim (øverst) til lyse (nederst) blinker, med tilstrækkelig inter-stimulus interval for at sikre mørk tilpasning. Ved slutningen af protokol, er gentagelse af fire blink med kort interval præsenteret fremkalde kegle medieret respons.
3. Analyse af ERG kurver
Bemærk: ERG og VEP analyse er blevet beskrevet i detaljer tidligere 3,9,10 The.følgende afsnit giver en kort oversigt.
- Eksportlicenser signaler i digital spænding-tid format til et regneark til dataanalyse.
- Rod photoreceptoral funktion
- Modellere forkanten af en bølge PIII med forskudt Gaussisk (ligning 1) 11.
PIII (i, t) = Rm PIII ∙ [1 - exp (- jeg ∙ S (t - t d) 2)] for t> t d (ligning 1) - Optimer pasform over en ensemble af to lyseste lysende energier 12,13 (dvs. 1,22 og 1,52 log cd.sm -2).
- Model op til 90% af a-tak-amplitude for at undgå post-receptoral indtrængen 14.
Bemærk: Modellen returnerer den mættede amplitude (Rm PIII, μV), følsomhed (S, m 2 .cd -1 .s -3) og forsinkelse (t d, ms) i photoreceptoral respons.
- Modellere forkanten af en bølge PIII med forskudt Gaussisk (ligning 1) 11.
- Rod bipolar celle funktion
- Digitalt trække PIII model (se ovenfor) fra de blandede bølgeformer til at returnere den blandede PII med overliggende oscillerende potentialer.
- For at udtrække stangen PII fra den blandede PII, digitalt trække kegle respons (3. eller 4. flash på 1,52 log cd.sm -2) fra den blandede PII (1 st flash på 1,52 log cd.sm -2).
- Derefter anvende en lavpasfilter til bølgeformen (46,9 Hz, -3 dB, Blackman vindue) til fjernelse oscillerende potentialer. Den resterende bølgeform er stangen PII svar 10.
- Uddrag stangen PII peak amplitude og plot det mod alle stimulus intensiteter (under -2 log cd.sm -2 og stang-isoleret PIO på 1,52 log cd.sm -2) 10.
- Model disse data ved hjælp af en hyperbolsk funktion (ligning 2), som giver et mål for den indre nethinde celle integritet.
V (i) = Vmax (i n / (i n+ K n)) (ligning 2)
Bemærk: Denne ligning returnerer maksimal PII respons (Vmax, μV), 1 / sensitivitet (k, log cd.sm-2) og hældningen af funktionen (n) 15.
- Cone bipolar cellefunktion
Bemærk: Da kegle reaktion er taget på en enkelt intensitet (1,52 log cd.sm -2) amplituden og timing er retuned på dette lysniveau.- Uddrag maksimal kegle PII respons 2,16.
- Uddrag implicit tid som denne maksimale respons svarer 2,16.
- Gangliecelle funktion
- Da STR er et lille signal, anvende et lavpasfilter med 50 Hz hak til bølgeform at eliminere højfrekvent og linje støj (46,9 Hz, -3 dB, Blackman vindue).
- Uddrag maksimal pSTR respons 3,17.
- Uddrag implicit tid som denne maksimale respons svarer 3,17.
4. Analyse af VEP bølgeformer
- Uddrag maksimale og minimale dele af VEP (P1, N1 og P2). For detaljer se referencer 3,6.
- Express amplituder som trough-to-peak amplituder fra deres foregående peak eller trug (P1N1 og N1P2) 3,6.
- Uddrag implicit tid (det), som denne maksimale respons svarer (P1 det, N1 det, P2 det) 3,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ERG a-bølge (> -1,38 log cd.sm -2), b-bølger (> - 4,99 log cd.sm -2) STR'er (<- 4,99 log cd.sm -2) og VePS (> - 0,52 log cd.sm -2) blev registreret samtidigt (figur 1 og 3). Ved meget dim blinker, er en positiv STR (pSTR) set ved ca. 110 ms efter flashen, og en negativ STR (NSTR) ved ca. 220 ms (figur 1 og 2). En ERG med en stor b-bølge, toppe mellem 50 til 100 msek efter starten af en moderat flash der kan analyseres for dets PII respons (Figur 1 og 2). På denne stimulus energi, den negative a-bølge før toppen er ubetydelig. På lysere lysende energier negativ afbøjning a-bølge bliver mere fremtrædende, som kan kvantificeres med PIII respons (figur 2). Den scotopic VEP bølgeform viser en negativ reaktion (P1N1, 15-70 msek vindue) efterfulgt af en positiv afbøjning (N1P2; 30 - 100 ms) (figur 3 og 4).
Figur 1. Gruppe Gennemsnitlige ERG bølgeformer. ERG ændrer med stigende stimulus intensitet. Numre til venstre for bølgeform indikerer den lysende eksponering anvendes til at fremkalde bølgeform. Bemærk de forskellige amplitude og tidsplaner for hvert panel. Ved svagere lysende energier de positive og negative komponenter af scotopic reaktionstærskel kan fremkaldes (pSTR, NSTR). Som stimulus energier får lysere, kan a og b-bølge respons analyseres, og en parret-flash paradigme tillader kegle respons, der skal måles. Klik her for at se en større version af dette tal.
pload / 54.158 / 54158fig2.jpg "/>
Figur 2. ERG analyse. (A) Rod fotoreceptor funktion kan analyseres ved anvendelse af en PIII at modellere en-bølge. A-bølger på 1,22 og 1,52 log cd.sm -2 (ubesatte cirkler, ○) er egnet som et ensemble med en PIII (grå linjer, ligning 1) til 90% af den mindste som returnerer Rm PIII (mættet amplitude, μV) S (følsomhed, m 2 .cd -1 .s -3) og TD (timing forsinkelse, msek) parametre. (B) Rod bipolar celle funktion (gennemsnit ± SEM) kan analyseres ved at modellere intensiteten respons serie af stangen PII (ubesatte cirkler ○) med en Naka-Rushton funktion (grå linie). Dette returnerer V max (mættet amplitude, μV), k (1 / følsomhed, log cd sm -2) og n (hældning). (C) Retinal ganglion celle funktion analyseres ved dim lysende energier og kvantificeres ved pSTR peak amplitude (pSTR amp) og timing (pSTR det (D) Cone bipolar celle funktion fremkaldes med en parret-flash paradigme kvantificeret ved kegle PII peak amplitude (kegle PII amp) og timing (kegle PII det). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Gruppe Gennemsnitlig VEP bølgeformer. Formen af VEP bølgeform ændrer med stigende stimulus energi. Tal til venstre for kurven angiver den lysende eksponering anvendes til at fremkalde den bølgeform. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figure 4. VEP Analyse og Intensitet Reaktion Function. (A) Amplitude analyse af VEP tages som top til lavpunkt (P1N1) og laveste og den maksimale (N1P2) amplituder. De implicitte gange (det) af disse reaktioner er også returneres (P1 det, N1 det, P2 det). (B) Den VEP P1N1 amplitude (gennemsnit ± SEM) stiger med stigende stimulus energi. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ERG og VEP er objektive mål for visuel funktion fra nethinden og cortex, hhv. Fordelen ved samtidig optagelse er, at en mere omfattende udsigt over hele visuelle pathway, der ydes. Konkret kunne supplerende oplysninger fra deres samtidige vurdering giver en klarere afgrænsning af skadestedet i den visuelle pathway (fx for lidelser med overlappende ERG endnu tydelig VEP manifestationer 18, hvor optisk neuropati kan sameksistere med primær cerebral atrofi 19, 20, eller når VEP tab kan forveksles med manifestation af skader flere steder i visuel vej 21,22). Ved at måle ERG og VEP samtidigt, kan et indeks af gevinsten mellem retinal og kortikal respons også afledes. Det kan give et nyttigt redskab til at opdage subtile patologiske forandringer. Den nuværende protokol giver mulighed for ERG og VEP måling i almindeligt anvendte laboratorierotter men kan let være i annonceApted til andre pattedyrarter 23-25. ERG og VEP waveforms fra gnavere giver et rimeligt præklinisk surrogat for reaktioner observeret i humane øjne 26-28.
Ved at designe en specifik stimulus-protokol, kan både ERG og VEP respons opnås i løbet af en enkelt optagelse session. Tabel 1 viser en progression i lysniveauer med passende hensyntagen til inddrivelse tid mellem på hinanden følgende blinker. Denne protokol giver en balance mellem behovet for at maksimere signal-til-støj egenskaber og begrænse optagetiden inden bedøvelsen vindue leveres af en enkelt dosis af ketamin: xylazin. Derfor kan denne teknik være nyttige for en objektiv kvantitativ måling af synsfunktionen til forskning i grundlæggende fysiologi og sygdom.
En samlet vurdering af det visuelle system kan opnås ved samtidig at vurdere bilaterale retinale svar og visuelt fremkaldt kortikale svar. Dog kan hver teknik også gennemføres i isolation og monocularly stedet for Binokulær at forenkle proceduren. Den nuværende protokol beskriver scotopic ERG og VEP signaler valgt at isolere stangen-pathway, da rotter har en stang-dominerede nethinden. Hvis lys tilpasset responser er af større interesse for undersøgelsen, er det også muligt at udføre fotopiske ERG og VEP signaler ved præ-tilpasning til en baggrund lys.
En væsentlig begrænsning ved denne teknik er behovet for at gennemføre proceduren i bedøvede betingelser for, at en stabil elektrode placering. Ikke desto mindre denne tilgang giver robuste signal-til-støj egenskaber muliggør påvisning af subtile ændringer behandlingsmuligheder.
På grund af den lille amplitude af STR og dens følsomhed over for lys tilpasning, flere skridt der skal observeres nøje for at sikre en vellykket registrering af dette svar. For det første skal gennemføres, der omfatter tilstrækkelige mørke tilpasningnatten over mørk tilpasning (≥ 8 timer), elektrodeplacering under dim rød belysning (17,4 cd.m -2, λ max = 600 nm), og re-mørke tilpasning efter en dim test-flash (10 min til - 0,52 log cd. sm -2). Endvidere kan signal-til-støj egenskaber STR forbedres ved at midle over flere signaler (dvs. 20 signaler) opsamlet med korte inter-stimulus intervaller (dvs. 2 sek). En af fordelene ved denne omfattende vurdering af begge øjne og cortex er at muliggøre sammenligning med den kontralaterale optagelse 3. Som bør tages sådan, særlig omhu i elektrode making (dvs. samme størrelse og formede elektroder), for at sikre minimal inter-eye og inter-cortical variabilitet.
I betragtning af den omfattende brug af både ERG og VEP teknikker for at in vivo målinger af den visuelle pathway og dens sygdomsrelaterede processer, vil det være nyttigt at indsamle andre forløb-specifikke protocols (fx ON / OFF eller kegle undertype specifik), og udføre samtidige ERG / VEP optagelser med forskellige stimulus modaliteter (f.eks flimmer, mønster, savtakket) for at udvide anvendelsen af denne teknik i kliniske diagnoser. En anden logisk skridt af denne ansøgning i fremtiden ville også være at registrere ERG og VEP samtidigt fra bevidst 29, frit bevægelige dyr for at undgå bedøvende påvirkninger på neurale fysiologi 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alligator clip | generic brand | HM3022 | Stainless steel 26 mm clip for connecting VEP screw electrodes to cables |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML 135 | For amplifying ERG and VEP signals |
| Carboxymethylcellulose sodium 1.0% | Allergan | CAS 0009000-11-7 | Viscous fluid for improving signal quality of the active ERG electrode |
| Carprofen 0.5% | Pfizer Animal Health Group | CAS 53716-49-7 | Proprietary name: Rimadyl injectable (50 mg/ml). For post-surgery analgesia, diluted to 0.5% (5 mg/ml) in normal saline |
| Chlorhexadine 0.5% | Orion Laboratories | 27411, 80085 | For disinfecting surgical instruments |
| Circulating water bath | Lauda-Königshoffen | MGW Lauda | For maintaining body temperature of the anesthetized animal during surgery and electrophysiological recordings |
| Dental amalgam | DeguDent GmbH | 64020024 | For encasing the electrode-skull assembly to make it more robust |
| Dental burr | Storz Instruments, Bausch and Lomb | #E0824A | A miniature drill head of ~ 0.7 mm diameter for making a small hole in the skull over each hemisphere to implant VEP screws |
| Drill | Bosch | Dremel 300 series | An automatic drill for trepanning |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier |
| Faraday Cage | custom-made | Ensures light proof to maintain dark adaptation. Encloses the Ganzfeld setup to improve signal to noise ratio | |
| Gauze swabs | Multigate Medical Products Pty Ltd | 57-100B | For drying the surgical incision and exposed skull surface during surgery |
| Ganzfeld integrating sphere | Photometric Solutions International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size | |
| Velcro | VELCRO Australia Pty Ltd | VELCRO Brand Reusable Wrap | Hook-and-loop fastener to secure the electrodes and the animal on the recording platform |
| Isoflurane 99.9% | Abbott Australasia Pty Ltd | CAS 26675-46-7 | Proprietary Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for VEP electrode implant surgery |
| Ketamine | Troy Laboratories | Ilium Ketamil | Proprietary name: Ketamil Injection, Brand: Ilium. Pharmaceutical-grade anesthetic for electrophysiological recording |
| Luxeon LEDs | Phillips Lighting Co. | For light stimulation twenty 5 W and one 1 W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the ERG active electrode during recordings |
| Needle electrode | Grass Telefactor | F-E2-30 | Subcutaneously inserted in the tail to serve as the ground electrode for both the ERG and VEP |
| Phenylephrine 2.5% minims | Bausch and Lomb | CAS 61-76-7 | Instilled with Tropicamide to achieve maximal dilation for ERG recording |
| Povidone iodine 10% | Sanofi-Aventis | CAS 25655-41-8 | Proprietory name: Betadine, Antiseptic to prepare the shaved skin for surgery 10%, 500 ml |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML 785 | Controls the LEDs |
| Proxymetacaine 0.5% | Alcon Laboratories | CAS 5875-06-9 | For corneal anaesthesia during ERG recordings |
| Saline solution | Gelflex | Non-injectable, for electroplating silver wire electrodes | |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus via the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make active and inactive ERG electrodes, and the inactive VEP electrode |
| Stainless streel screws | MicroFasterners | 0.7 mm shaft diameter, 3 mm in length to be implanted over the primary visual cortex and serve as the active VEP electrodes | |
| Stereotaxic frame | David Kopf | Model 900 | A small animal stereotaxic instrument for locating the primary visual cortices according to Paxinos & Watson's 2007 rat brain atlas coordinates |
| Surgical blade | Swann-Morton Ltd. | 0206 | For incising the area of skin overlaying the primary visual cortex to implant the VEP electrodes |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co.,Ltd | 3-0 silk braided suture non-absorbable, for skin retraction during VEP electrode implantation surgery | |
| Tobramycine eye ointment 0.3% | Alcon Laboratories | CAS 32986-56-4 | Proprietary name: Tobrex. Prophylactic antibiotic ointment applied around the skin wound after surgery |
| Tropicamide 0.5% | Alcon Laboratories | CAS 1508-75-4 | Proprietary name: 0.5% Mydriacyl eye drop, Instilled to achieve mydriasis for ERG recording |
| Xylazine | Troy Laboratories | Ilium Xylazil-100 | Pharmaceutical-grade anesthetic for electrophysiological recording |
| Pipette tip | Eppendorf Pty Ltd | 0030 073.169 | Eppendorf epTIPS 100 - 5,000 ml, for custom-made electrodes |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | spreadsheet software for data analysis |
| Lethabarb Euthanazia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | LETHA450 | 325 mg/ml pentobarbital sodium for rapid euthanazia |
References
- Nguyen, C. T. O., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Dietary omega-3 fatty acids and ganglion cell function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3586-3594 (2008).
- Weymouth, A. E., Vingrys, A. J. Rodent electroretinography: methods for extraction and interpretation of rod and cone responses. Prog Retin Eye Res. 27, 1-44 (2008).
- Tsai, T. I., Bui, B. V., Vingrys, A. J. Effect of acute intraocular pressure challenge on rat retinal and cortical function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 1067-1077 (2014).
- Cowey, A., Franzini, C. The retinal origin of uncrossed optic nerve fibres in rats and their role in visual discrimination. Exp Brain Res. 35, 443-455 (1979).
- Weinstein, G. W., Odom, J. V., Cavender, S. Visually evoked potentials and electroretinography in neurologic evaluation. Neurol Clin. 9, 225-242 (1991).
- Odom, J. V., et al. Visual evoked potentials standard (2004). Doc Ophthalmol. 108, 115-123 (2004).
- Ridder, W. H., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of cataract development in anesthetized mice. Exp Eye Res. 75, 365-370 (2002).
- Nixon, P. J., Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. The contribution of cone responses to rat electroretinograms. Clin Experiment Ophthalmol. 29, 193-196 (2001).
- Bui, B. V., et al. Using the electroretinogram to understand how intraocular pressure elevation affects the rat retina. J Ophthalmol. 2013, 262467 (2013).
- Nguyen, C. T., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Dietary omega-3 fatty acids and ganglion cell function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3586-3594 (2008).
- Hood, D. C., Birch, D. G. A quantitative measure of the electrical activity of human rod photoreceptors using electroretinography. Vis Neurosci. 5, 379-387 (1990).
- Birch, D. G., Hood, D. C., Locke, K. G., Hoffman, D. R., Tzekov, R. T. Quantitative electroretinogram measures of phototransduction in cone and rod photoreceptors - Normal aging, progression with disease, and test-retest variability. Arch Ophthalmol. 120, 1045-1051 (2002).
- Bui, B. V., Vingrys, A. J. Development of receptoral responses in pigmented and albino guinea-pigs (Cavia porcellus). Doc Ophthalmol. 99, 151-170 (1999).
- Robson, J. G., Saszik, S. M., Ahmed, J., Frishman, L. J. Rod and cone contributions to the a-wave of the electroretinogram of the macaque. J Physiol. 547, 509-530 (2003).
- Severns, M. L., Johnson, M. A. The care and fitting of Naka-Rushton functions to electroretinographic intensity-response data. Doc Ophthalmol. 85, 135-150 (1993).
- Bui, B. V., Fortune, B. Origin of electroretinogram amplitude growth during light adaptation in pigmented rats. Vis Neurosci. 23, 155-167 (2006).
- Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. J Physiol. 555, 153-173 (2004).
- Tremblay, F., Laroche, R. G., Debecker, I. The Electroretinographic Diagnosis of the Incomplete Form of Congenital Stationary Night Blindness. Vision Res. 35, 2383-2393 (1995).
- Bayer, A. U., Keller, O. N., Ferrari, F., Maag, K. P. Association of glaucoma with neurodegenerative diseases with apoptotic cell death: Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Am J Ophthalmol. 133, 135-137 (2002).
- Wostyn, P., Audenaert, K., De Deyn, P. P. An abnormal high trans-lamina cribrosa pressure difference: A missing link between Alzheimer's disease and glaucoma. Clinical Neurology and Neurosurgery. 110, 753-754 (2008).
- Yucel, Y. H., Zhang, Q. A., Weinreb, R. N., Kaufman, P. L., Gupta, N. Effects of retinal ganglion cell loss on magno-, parvo-, koniocellular pathways in the lateral geniculate nucleus and visual cortex in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 22, 465-481 (2003).
- Gupta, N., Yucel, Y. H. What changes can we expect in the brain of glaucoma patients. Survey of Ophthalmology. 52, 122-126 (2007).
- Kong, Y. X., et al. Impact of aging and diet restriction on retinal function during and after acute intraocular pressure injury. Neurobiol Aging. 33, 1115-1125 (2012).
- Bui, B. V., Sinclair, A. J., Vingrys, A. J. Electroretinograms of albino and pigmented guinea-pigs (Cavia porcellus). Aust N Z J Ophthalmol. 26, Suppl 1 98-100 (1998).
- Jobling, A. I., Wan, R., Gentle, A., Bui, B. V., McBrien, N. A. Retinal and choroidal TGF-beta in the tree shrew model of myopia: isoform expression, activation and effects on function. Exp Eye Res. 88, 458-466 (2009).
- Robson, J. G., Frishman, L. J.
- Robson, J. G., Frishman, L. J. The rod-driven a-wave of the dark-adapted mammalian electroretinogram. Prog Retin Eye Res. 39, 1-22 (2014).
- Hudnell, H. K., Boyes, W. K. The comparability of rat and human visual-evoked potentials. Neurosci Biobehav Rev. 15, 159-164 (1991).
- Charng, J., et al. Conscious wireless electroretinogram and visual evoked potentials in rats. PLoS One. 8, e74172 (2013).
- Hetzler, B. E., Berger, L. K. Ketamine-Induced Modification of Photic Evoked-Potentials in the Superior Colliculus of Hooded Rats. Neuropharmacology. 23, 473-476 (1984).
