Introduction
Mesure de l'électrorétinogramme (ERG) et potentiel évoqué visuel (VEP) fournir des évaluations quantitatives utiles de l'intégrité de la voie visuelle. L'ERG mesure les réponses électriques de la rétine à une stimulation lumineuse, tandis que la VEP mesure l'intégrité fonctionnelle correspondante des voies visuelles de la rétine au cortex visuel primaire suivant le même événement lumière. Ce manuscrit décrit un protocole pour l'enregistrement et l'analyse des réponses ERG et VEP dans un modèle de laboratoire couramment utilisé, le rat.
L'ERG fournit un indice de l'intégrité fonctionnelle d'un certain nombre de classes clés de cellules rétiniennes en quantifiant réponse électrique brute de la rétine à un flash de lumière. Une série coordonnée des flux ioniques initiée par l'apparition de lumière et de décalage, produire des changements détectables dans la tension qui peut être mesurée en utilisant des électrodes de surface placées à l'extérieur de l'œil. La forme d'onde résultante représente la combinaison d'un soiries de composants bien définis, différents en amplitude, le calendrier et la fréquence. Un important corpus de recherche a montré que ces composants sont relativement bien conservés dans de nombreux rétines vertébrés et que les composants peuvent être séparés les uns des autres. En choisissant judicieusement le stimulus (flash stimulus, fond, intervalle interstimulus) conditions et en choisissant des caractéristiques spécifiques de la forme d' onde composite à analyser , on peut être sûr de retourner une mesure d'un groupe spécifique de cellules rétiniennes 1,2. Ces caractéristiques sous-tendent l'utilité et donc les applications répandues de l'ERG en tant que mesure non-invasive de la fonction de la rétine. Ce manuscrit se concentre sur la méthodologie de mesure de l'ERG et l'analyse de ses caractéristiques pour renvoyer des informations sur certaines des principales classes de cellules de la rétine, à savoir photorécepteurs (la composante PIII), les cellules bipolaires (la composante PII) et les cellules ganglionnaires de la rétine (le positif seuil de réponse scotopique ou pstr).
3. Chez les rongeurs, la majorité (90 - 95%) des fibres du nerf optique de chaque decussate oculaire 4 et innervent le mésencéphale controlatéral. Contrairement à l'ERG, il est encore impossible d'attribuer les différentes composantes de la VEP à des classes de cellules spécifiques, 5 change donc partout le long de la voie visuelle pourrait affecter la forme d' onde VEP. Néanmoins, le VEP est une mesure non-invasive utile de la performance visuelle et de l'intégrité de la voie visuelle. Le VEP, lorsqu'il est utilisé en conjonction avec l'ERG, peut fournir une évaluation plus complète du système visuel (ie, la rétine / voie visuelle).
ERG et VEP enregistrements peuvent être effectuées de manière isolée ou en combinaison, en fonction de l'application. La méthodologie décrite dans ce document permet une évaluation simultanée de la rétine et du cortex électrophysiologie visuelle évoqué des deux yeux et les deux hémisphères chez les rats anesthésiés. Ceci est un moyen utile d'évaluer de façon plus complète la fonction rétinienne et les effets en amont que les changements dans la fonction rétinienne peuvent avoir sur la fonction corticale évoquée visuelle.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées selon le Code australien de pratiques pour le soin et l'utilisation des animaux à des fins scientifiques, établi par le Conseil de recherches médicales Santé nationale et en Australie. clairance éthique a été obtenue à partir de l'Université de Melbourne, Faculté des Sciences, Comité d'éthique des animaux (numéro d'homologation 0911322,1).
1. Pré-implantation chronique VEP Electrodes
Remarque: Si des signaux ERG et VEP simultanées doivent être collectés animaux doivent être implantés chirurgicalement avec VEP les électrodes au moins 1 semaine avant pour signaler la collecte.
- Stériliser le banc chirurgical avant l'expérimentation d'un nettoyage avec la chlorhexidine (0,5% dans 70% d'éthanol). Autoclave tout le matériel chirurgical avant utilisation. Couvrir l'animal avec un drap chirurgical stérilisé. Vérifiez que tous les expérimentateurs portent des masques chirurgicaux, des blouses et des gants stérilisés.
- Provoquer l' anesthésie avec de 3 à 3,5% d' isoflurane avec O 2 à un taux de 3 L / min. Maintenir anesthesia à 1,5% et de 2 L / min tout au long de l'intervention chirurgicale. Veiller à une profondeur suffisante de l'anesthésie par l'absence de patte de pincement réflexe.
- Appliquer 1% de carboxyméthylcellulose sodique sur la cornée pour éviter le dessèchement des yeux.
- Rasez 30 mm Surface x 30 mm sur le front, postérieure aux yeux et antérieure aux oreilles.
- Placez l'animal sur un coussin chauffant (37 ° C) pour maintenir la température du corps et de stabiliser la tête d'animaux avec un cadre stéréotaxique.
- Désinfecter la zone rasée avec 10% de povidone-iode à trois reprises. Évitez l'utilisation d'antiseptiques à base d'alcool pour la zone près de l'œil, étant compatible avec la norme de pratique énoncées par l'Association des technologues chirurgicaux.
- Faire une incision médiane-sagittale sur la tête avec un scalpel et de cette accise un cercle de diamètre ~ 20 mm de tissu dermique pour exposer l'os crânien.
- Retirer périoste sous-jacent par le grattage et le séchage avec de la gaze pour exposer les sutures crâniennes coronales et sagittales.
- Nousing une fraise dentaire fixée à une perceuse, trépaner deux trous (0,7 mm de diamètre, profondeur ~ 1 mm) à travers le crâne sur les deux hémisphères, les coordonnées stéréotaxiques: 7 mm caudale à bregma, 3 mm latéralement à la ligne médiane.
- Visser les vis en acier inoxydable (diamètre 0,7 mm, longueur 3 mm, stérilisé avec de la chlorhexidine) dans les deux trous pré-faites jusqu'à une profondeur de ~ 1 mm (2 mm de vis exposée) pour permettre l'ancrage ferme. Ce contact avec la dure-mère, sans endommager le tissu cortical sous-jacent.
- Préparer zone chirurgicale pour l'amalgame dentaire en séchant l'os crânien avec de la gaze, et rétracter la peau lâche avec deux 3-0 sutures à ~ 4 et 8 heures.
- Étaler l'amalgame dentaire sur le crâne exposé à fixer les électrodes à vis (des vis en acier inoxydable décrites à l'étape 1.10) en place. Veiller à ~ 1,5 mm des vis restent exposées pour l'enregistrement.
- Retirer les sutures de rétraction.
- Injecter 0,5% par voie sous cutanée carprofène (5 mg / kg) pour l'analgésie et une solution saline (chlorure de sodium à 0,9%, 10,5 ml), sous-cutanée pour le remplacement du fluide.
- Laisser l'animal à récupérer dans des cages séparées. Ne pas laisser l'animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale.
- Ne pas retourner animal à la compagnie d'autres animaux jusqu'à ce qu'il ait complètement récupéré de la chirurgie (minimum 5 jours).
- Continuer d'administrer 0,5% sous-cutanée carprofène pour l'analgésie (5 mg / kg) une fois par jour pendant 4 jours.
- Enregistrez ERG et VEP 1 semaine après la chirurgie.
2. ERG et VEP Enregistrement
- préparation de la collecte des données
- Utilisez un logiciel informatique pour déclencher simultanément stimulus et acquérir des données 2 selon les paramètres recommandés ci - dessous.
- Amplifier les signaux 3 (ERG: × 1000, VEP: x10,000) avec le gain réglé en interne par un pré-amplificateur et amplificateur isolé, et avec les deux yeux appariés pour l' impédance.
- taux d'échantillonnage défini pour l'ERG à 4 kHz sur une 650fenêtre d'enregistrement msec (2560 points), Pour ce faire, cliquez sur l'onglet pour "base de temps" dans le logiciel d'acquisition de données (pour le nom et la version du logiciel, voir le tableau des matériaux), sélectionnez "2560" pour les échantillons, et "500 ms" pour le temps qui sera de retour d'une fenêtre d'enregistrement de 650 msec.
- Utilisez la même méthode pour définir la fréquence d'échantillonnage pour le VEP à 10 kHz sur une époque msec 250. Autoriser 10 msec de base pré-stimulus pour les deux enregistrements ERG et VEP. Pour ce faire, cliquez sur l'onglet "Configuration"; sélectionnez "Stimulateur" pour faire apparaître une nouvelle fenêtre de dialogue; dans cette fenêtre sélectionner "impulsion" dans la liste déroulante "Mode" vers le bas; et définir la valeur de "retard" à "10 ms".
- passe-bande ERG Set filtrage à 0,3 - 1000 Hz (- 3 dB). Cela se fait en cliquant sur "Bio Amplifier» dans le logiciel d'acquisition de données. Définissez ensuite la valeur pour "High Pass" à "0,3 Hz", et la valeur de "passe-bas" à "1 kHz».
- En utilisant la méthode indiquée ci - dessus dans 2.1.1.3, définissez VEP paramètres passe-bande à 0,1 - 100 Hz (- 3 dB) tel que recommandé par la Société internationale pour électrophysiologie clinique de Vision (ISCEV) pour les enregistrements VEP humain 6.
- Utilisez un logiciel informatique pour déclencher simultanément stimulus et acquérir des données 2 selon les paramètres recommandés ci - dessous.
- Préparation de l'électrode
- Custom-faire les électrodes inactives ERG actifs / inactifs et VEP actifs / en attachant un fil d'argent ou d' une pince crocodile à un conducteur d'électrode, respectivement 2. obtenir commercialement électrode de masse.
- Pour les électrodes sur mesure 4, couper l'extrémité mâle de l'extension d'électrode. Enlever 1 cm du revêtement isolant de polytétrafluoroéthylène externe avec une lame de scalpel assurant le fil interne ne soit pas endommagé.
- Pré-fashion les ERG électrodes inactives en coupant une longueur de 70 mm de fil d'argent (épaisseur 0,3 mm) et formant une boucle ~ 8 mm de diamètre pour encercler l'œil de rat. Préparer un cercle uniforme en formant la boucle sur une pointe de pipette 1 ml.
- Pré-fashion les ERG électrodes actives en coupant une longueur de 30 mm de fil d'argent et formant une petite boucle à contacter doucement la cornée de rat (~ 1-2 mm de diamètre)
- Fixer solidement les électrodes (2 ERG actif, 2 ERG inactive, 1 VEP inactif) à la tête de l'électrode par enlaçant l'argent avec le fil interne exposée.
- Isoler métal exposé en excès avec du ruban de masquage pour réduire les artefacts photovoltaïques.
- Sur les électrodes inactives ERG coller un petit morceau de crochet et boucle de fixation (~ 5 mm x 20 mm) pour le ruban de masquage pour permettre la fixation stable à la courroie de cou de rongeur.
- Fixez la pince crocodile sur le fil interne de l'électrode conduit à rendre les électrodes actives VEP.
- Avant enregistrements, galvanoplastie les surfaces exposées des fils d'argent ( par exemple, la bague inactive et active pointe) avec du chlorure en utilisant une source de courant continu 9 V pendant 20 s pour améliorer la conduction du signal.
- Pour ce faire, plongez la pointe d'argent du fil électrode ERG (agissant comme anode d'une cellule primaire) dans une solution saline normale; l'autre extrémité de ce fil d'électrode à la borne positive d'une pile de 9 V.
- Branchez un autre fil (la cathode) à la borne négative de la batterie, et plongez l'autre extrémité dans une solution saline ainsi. Déconnecter après 20 secondes et observer la pointe de ruban du fil d'électrode ERG à revêtir uniformément dans la couleur blanche.
Remarque: préparer de nouvelles électrodes ERG pour chaque session expérimentale (~ jusqu'à 8 heures) afin d'assurer la perméabilité du revêtement de chlorure.
- préparation des animaux
- Dark-adapter les animaux pendant la nuit (≥ 8 h) avant les enregistrements dans une chambre étanche à la lumière. Assurer adaptation à l'obscurité maximale en éteignant les lumières de la pièce, la fermeture de toutes les portes et stores. Minimiser les fuites de lumière en plaçant des matériaux légers à l'épreuve autourjonctions de portes / fenêtres et les écrans d'ordinateur de placement à l'extérieur épais rideaux noirs.
- Procéder à la préparation des animaux dans une pièce sombre à l'aide de la diode faible émission de lumière rouge (LED; 17,4 cd.m -2, λ max = 600 nm) pour maintenir la sensibilité de la tige.
- Anesthésier le rat par injection de kétamine / xylazine (60: 5 mg / kg) par voie intramusculaire. Confirmer une profondeur suffisante de l'anesthésie par l'absence d'un réflexe patte de pincement.
- Pour maintenir la sédation, administrer une autre dose d'anesthésie (50% de la dose initiale) après 50 min si nécessaire.
- Pour anesthésie topique supplémentaire appliquer une baisse de 0,5% proximétacaïne à chaque oeil, et clignotera hors excès de liquide.
- Pour la dilatation des pupilles appliquer une baisse de 0,5% tropicamide à chaque œil, puis sécher l'excès de liquide.
- ERG et VEP électrode positionnement
- Placer l'animal sur la plate-ERG en face de la cuvette Ganzfeld située dans la cage de Faraday. Évitez d'utiliser un coussin chauffant électrique, comme cune introduction du bruit électrique dans les enregistrements électrophysiologiques. Remarque: La plate-forme est fixée à une plate-forme de l'eau chauffée en circulation pour maintenir la température corporelle.
- animale sécurisé à la plate-forme avec une bande de crochet et boucle de fixation placé fermement mais pas serré autour de la nuque.
- Accrocher l'électrode VEP inactive autour incisives inférieures du rat anesthésié.
- Placer les électrodes inactives ERG en encerclant l'anneau scléral non effractive autour de l'équateur de l'œil. Stabiliser ce en attachant des électrodes à l'attache bande crochet et boucle autour de la nuque. Répétez l'opération pour l'oeil controlatéral.
- Fixer VEP Les électrodes actives en attachant des pinces crocodile à vis en acier inoxydable pré-implantés sur le crâne.
- Placer une petite goutte de 1% de sodium carboxyméthylcellulose sur la cornée avant le placement de l'électrode active ERG pour améliorer la qualité du signal. Remarque: Le fluide de viscose contribue également à maintenir l'hydratation de la cornée à travers l'expérimentation à des miniMize la formation de type dessiccation cataracte chez les rongeurs 7.
- Placer une petite goutte de 1% de carboxyméthylcellulose sodium sur les incisives inférieures pour améliorer le contact de l'électrode inactive VEP et donc la qualité du signal.
- Placer les électrodes actives ERG toucher légèrement la surface cornéenne centrale en utilisant un micromanipulateur attaché à un bras stéréotaxique sur mesure.
- Insérer 2 - 5 mm de l'aiguille électrode de masse (en acier inoxydable) sous-cutanée dans la queue.
- Si nécessaire sécher tout excès de liquide de la paupière inférieure avant l'enregistrement pour améliorer la qualité du signal.
- plate-forme de diapositives plus proche de la cuvette Ganzfeld assurant que les yeux de l'animal aligner avec l'ouverture de la cuvette pour permettre un éclairage uniforme des deux rétines (voir étape 2.4.1).
- Fermez la cage de Faraday pour réduire les bruits parasites.
- Collecte de données
- Utilisez un flash de test faible (- 0,52 log cd.sm -2) pour déterminer si l' électrode placement est satisfaisant 2. Dans des conditions de contrôle cela se traduirait par une amplitude de l'ERG ~ 800 mV et une variabilité inter-oculaire ne dépassant pas 10%. Si les électrodes de repositionnement requis.
- Après le test-flash permettent aux animaux à foncé adapter pendant 10 min dans l'obscurité totale avant l'enregistrement.
- clignote Présenter des stimuli lumineux en utilisant un bol Ganzfeld tout collecte ERG et VEP signaux simultanément sur une msec fenêtre temporelle ~ 500. Les progrès de gradateur pour plus lumineux niveaux de lumière afin de maintenir adaptation à l'obscurité suffisante pour des formes d'onde particulières.
- Recueillir des signaux sur une gamme d'énergies lumineuses pour obtenir des STR, b-ondes et a / b des formes d'onde à ondes de l'ERG. plusieurs signaux moyens aux niveaux de gradation de lumière (20 répétitions) et moins aux énergies plus lumineux lumineuses (1 répétition). Peu à peu, d'allonger l'intervalle inter-stimulus 1-180 sec de dimmest au niveau de lumière la plus brillante. Voir le tableau 1 pour un exemple de protocole.
- Pour isofin les réponses de bâtonnets et des cônes ERG, utiliser un paradigme appariées flash 8. Initier quatre clignote à 1,52 log cd.sm -2 avec un intervalle de 2 500 msec inter-stimulus entre les deux. Soustraire numériquement la forme d' onde de cône (3 e ou 4 e flash) à partir de la forme d' onde mixte (1 er flash) pour obtenir la réponse de la tige putative.
- Pour enregistrer des signaux VEP, moyenne 20 répétitions aux énergies plus lumineux lumineuses (c. -à - 0,52 à 1,52 log cd.sm -2, 5 sec d' intervalle inter-stimulus). Notez que le premier flash dans cette séquence renvoie la réponse adaptée à l'obscurité conventionnelle ERG.
- Comptez 1 - 3 min pour re-adaptation après balaie (20) VEP avant la brillante prochaine ERG étape, en fonction de l'énergie lumineuse.
- Après l'achèvement de la collecte des données, l'euthanasie des animaux anesthésiés par injection intracardiaque de pentobarbital sodique (325 mg / ml, 3 ml).
| Waveform | L' énergie de la lumière de stimulation (log cd.sm -2) | Le nombre de répétitions | intervalle interstimulus (sec) |
| STR | -6,24 | 20 | 2 |
| STR | -5.93 | 20 | 2 |
| STR | -5.6 | 20 | 2 |
| STR | -5,33 | 20 | 2 |
| Rod b-ondes | -4,99 | dix | 2 |
| Rod b-ondes | -4.55 | dix | 2 |
| Rod b-ondes | -4.06 | 5 | 5 |
| Rod b-ondes | -3.51 | 5 | 5 |
| Rod b-ondes | -3.03 | 1 | 15 |
| Rod b-ondes | -2.6 | 1 | 15 |
| Rod b-ondes | -1.98 | 1 | 15 |
| a- mixte / b-ondes | -1.38 | 1 | 30 |
| a- mixte / b-ondes | -0.94 | 1 | 30 |
| Flash 1: mixte moyenne a- / b-vague de 20: VEP | -0.52 | 20 | 5 |
| (90 secondes avant le prochain) | |||
| Flash 1: mixte moyenne a- / b-vague de 20: VEP | 0,04 | 20 | 5 |
| (120 secondes avant la prochaine) | |||
| Flash 1: mixte moyenne a- / b-vague de 20: VEP | 0,58 | 20 | 5 |
| (180 secondes avant la prochaine) | |||
| Flash 1: mixte moyenne a- / b-vague de 20: VEP | 1.2 | 20 | 5 |
| (180 secondes avant la prochaine) | |||
| Flash 1: mixte moyenne a- / b-vague de 20: VEP | 1.52 | 20 | 5 |
| (180 secondes avant la prochaine) | |||
| Cone a- / b-ondes | 1.52 | 4 | 0,5 |
Tableau 1. ERG et protocole d' enregistrement VEP utilisant une gamme d'énergie de stimulation. Progrès des présentations de stimulation de faible ( en haut) à vif ( en bas) clignote, avec suffisamment d' intervalle inter-stimulus pour assurer adaptation à l' obscurité. A la fin du protocole, la répétition de quatre flashes avec court intervalle est présenté pour déclencher la réponse du cône médiation.
3. Analyse de l'ERG Waveforms
Note: ERG et VEP analyse a été décrite en détail précédemment 3,9,10 La.sections suivantes donnent un bref aperçu.
- signaux d'exportation au format numérique tension-temps à un logiciel de tableur pour l'analyse des données.
- Rod fonction photoreceptoral
- Modéliser le bord d' attaque de l'onde-PIII avec un gaussien retardé (Equation 1) 11.
PIII (i, t) = Rm PIII ∙ [1 - exp (- i ∙ S (t - t d) 2)] pour t> t d (équation 1) - Optimiser l'ajustement sur un ensemble de deux énergies plus brillants lumineux 12,13 (ie, 1,22 et 1,52 log cd.sm -2).
- Modèle jusqu'à 90% de l'amplitude d' une onde pour éviter les intrusions post-receptoral 14.
Remarque: Le modèle renvoie l'amplitude saturée (Rm PIII, uV), la sensibilité (S, m 2 .cd -1 .s -3) et le retard (t d, msec) de la réponse photoreceptoral.
- Modéliser le bord d' attaque de l'onde-PIII avec un gaussien retardé (Equation 1) 11.
- Rod bipolaire fonct cellulaireion
- soustraire numériquement le modèle PIII (voir ci-dessus) à partir des formes d'onde mixtes pour renvoyer le PII mixte avec des potentiels oscillatoires sus-jacentes.
- Pour extraire le PII de la tige du PII mixte, soustraire numériquement la réponse du cône (3 e ou 4 e éclair à 1,52 log cd.sm -2) à partir du mélange PII (1 er éclair à 1,52 log cd.sm -2).
- Ensuite, appliquer un filtre passe-bas à la forme d'onde (46,9 Hz, -3 dB, fenêtre Blackman) pour éliminer les potentiels oscillatoires. La forme d' onde restante est la réponse de la PII de tige 10.
- Extraire la tige PII amplitude crête et tracer contre toutes les intensités de stimulation (inférieure à -2 PII log cd.sm -2 et tige-isolé à 1,52 log cd.sm -2) 10.
- Modèle ces données à l'aide d'une fonction hyperbolique (équation 2), qui fournit une mesure de l'intégrité intérieure des cellules rétiniennes.
V (i) = Vmax (i n / (n iK + n)) (équation 2)
Note: Cette équation retourne réponse maximale PII (V max, uV), 1 / sensibilité (k, log cd.sm-2) et la pente de la fonction (n) 15.
- fonction de cellule bipolaire Cone
Remarque: Comme la réponse du cône est prise à une seule intensité (1,52 log cd.sm -2) l'amplitude et le timing sont resyntonisés à ce niveau de lumière.- Extrait cône maximal réponse PII 2,16.
- Extraire le temps implicite à laquelle cette réponse maximale correspond 2,16.
- la fonction des cellules ganglionnaires
- Comme le STR est un petit signal, appliquer un filtre passe-bas avec 50 Hz cran à la forme d'onde pour éliminer haute fréquence et le bruit de ligne (46,9 Hz, -3 dB, fenêtre Blackman).
- Extrait réponse pstr maximale 3,17.
- Extraire le temps implicite à laquelle cette réponse maximale correspond 3,17.
4. Analyse des VEP Waveforms
- Extraire les composantes maximales et minimales de la VEP (P1, N1 et P2). Pour plus de détails voir les références 3,6.
- Amplitudes express que auge à crête amplitudes de leur pic précédent ou creux (P1N1 et N1P2). 3,6-
- Extraire le temps implicite (it) à laquelle cette réponse correspond maximale (P1 il, N1 il, P2 il) 3,6.
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Representative Results
L'ERG a-wave (> -1.38 log cd.sm -2), b-ondes (> - 4,99 log cd.sm -2) DOD (<- 4,99 log cd.sm -2) et les VEPs (> - 0,52 log cd.sm -2) ont été enregistrés simultanément (Figure 1 et 3). A clignote très faibles, un STR positif (pstr) est observée à environ 110 ms après le flash, et un STR négatif (NSTR) , à environ 220 msec (figures 1 et 2). Un ERG avec un grand b-ondes, des pics entre 50 à 100 msec après l'apparition d'un flash modérée qui peut être analysé pour sa réponse PII (figures 1 et 2). A cette énergie de relance, le négatif d'une onde avant le pic est négligeable. A des énergies plus lumineux lumineux de la déviation négative d' une onde devient plus important qui peut être quantifiée avec la réponse PIII (figure 2). La forme d'onde scotopique de VEP montre une réponse négative (P1N1; 15-70 fenêtre msec), suivie par une déviation positive (N1P2; 30 - 100 ms) (figures 3 et 4).
Figure 1. Groupe moyen ERG Waveforms. L'ERG modifie avec l' augmentation de l' intensité du stimulus. Les nombres à gauche de la forme d'onde indiquent l'exposition lumineuse utilisée pour obtenir la forme d'onde. Notez les différentes échelles d'amplitude et de temps pour chaque panneau. Au gradateur énergies lumineuses composantes positives et négatives de la réponse de seuil scotopique peuvent être provoquées (pstr, NSTR). Comme les énergies de relance deviennent plus claires, a et b-wave réponse peut être dosée, et un paradigme appariées flash permet la réponse du cône à mesurer. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 2. ERG analyse (A) la fonction des photorécepteurs. Rod peut être testée en utilisant un PIII pour modéliser l'une d'onde. A-ondes à 1,22 et 1,52 log cd.sm -2 (cercles non remplis, ○) sont en forme comme un ensemble avec un PIII (lignes grises, l' équation 1) à 90% du minimum qui retourne Rm PIII (amplitude saturée, uV) S (sensibilité, m 2 .cd -1 .s -3) et td (délai de temporisation, msec) paramètres. (B) la fonction des cellules bipolaires Rod (moyenne ± SEM) peuvent être analysés par la modélisation de la série de réponse d'intensité du PII de tige (cercles non remplis ○) avec une fonction Naka-Rushton (ligne grise). Cela renvoie V max (amplitude saturée, uV), k (1 / sensibilité, connectez - cd sm -2) et n (pente). (C) la fonction des cellules ganglionnaires de la rétine est analysée à des énergies lumineuses faibles et quantifiée par pstr amplitude crête (pstr amp) et le calendrier (pstr il (D) fonction de cellule bipolaire Cone est provoquée par un paradigme apparié-flash quantifiée par cône PII amplitude crête (cône d'ampli PII) et le calendrier (cône PII it). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Groupe moyen VEP Waveforms. La forme de la forme d' onde VEP modifie avec l' augmentation de l' énergie de stimulation. Les nombres à gauche de la forme d' onde indiquent l'exposition lumineuse utilisée pour obtenir la forme d' onde. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. VEP Analyse et fonction d'intensité de réponse. (A) d'analyse Amplitude du VEP est pris comme sommet au creux (P1N1) et le creux à pic (N1P2) amplitudes. Les temps implicites (il) de ces réponses est également retourné (P1 elle, N1 il, P2 il). (B) L'amplitude VEP P1N1 (moyenne ± SEM) augmente avec l' augmentation de l' énergie de relance. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande cette figure.
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Discussion
L'ERG et VEP sont des mesures objectives de la fonction visuelle de la rétine et du cortex, respectivement. L'avantage de l'enregistrement simultané est qu'une vision plus globale de l'ensemble de la voie visuelle est assurée. Plus précisément, les informations complémentaires de leur évaluation simultanée pourrait fournir une délimitation plus claire du site de la lésion dans la voie visuelle (par exemple, pour les troubles qui se chevauchent encore ERG distincte VEP manifestations 18, lorsque la neuropathie optique peut co-exister avec une atrophie cérébrale primaire 19, 20, ou lorsque la perte VEP peut être confondu par la manifestation de blessures à plusieurs endroits dans la voie visuelle 21,22). En mesurant l'ERG et VEP en même temps, un indice du gain entre la rétine et le cortex réaction peut également être dérivé. Cela peut fournir un outil utile pour détecter les changements pathologiques subtiles. Le protocole actuel permet ERG et VEP mesure chez les rats de laboratoire couramment utilisés, mais peut facilement être adApted à d' autres espèces de mammifères 23-25. ERG et VEP formes d' onde de rongeurs fournissent un substitut préclinique raisonnable pour les réponses observées dans les yeux humains 26-28.
En concevant un protocole de stimulus spécifique, à la fois la réponse ERG et VEP peut être obtenu au cours d' une seule session d'enregistrement. Le tableau 1 montre une progression dans les niveaux de lumière avec un examen approprié du temps de récupération entre les flashes consécutifs. Ce protocole prévoit un équilibre entre la nécessité d'optimiser les caractéristiques signal-bruit et de limiter le temps d'enregistrement dans la fenêtre anesthésique fourni par une seule dose de kétamine: xylazine. Par conséquent, cette technique peut être utile pour une mesure quantitative objective de la fonction visuelle pour la recherche en physiologie de base et de la maladie.
Une évaluation globale du système visuel peut être obtenue en évaluant simultanément les réponses rétiniennes bilatérales et réponses corticales évoqués visuels. Cependant, chaque technique peut également être réalisée de manière isolée et monoculaire au lieu de binoculairement de simplifier la procédure. Le protocole actuel décrit les signaux ERG scotopique et VEP choisis pour isoler la tige-voie étant donné que les rats ont une rétine de tige dominée. Si les réponses de lumière adaptées sont un plus grand intérêt à l'étude, il est également possible d'effectuer des signaux ERG et VEP photopique en pré-adaptation à une lumière de fond.
Une limitation majeure de cette technique est la nécessité de mener la procédure dans des conditions anesthésiés pour permettre le placement des électrodes stable. Néanmoins, cette approche fournit des caractéristiques robustes signal-bruit permettant de détecter les changements de traitement subtiles.
En raison de la faible amplitude du STR et sa sensibilité à la lumière d'adaptation, plusieurs étapes doivent être étroitement surveillés pour assurer un enregistrement réussi de cette réponse. Tout d'abord, adaptation à l'obscurité suffisante doit être mis en œuvre, qui comprendadaptation obscurité pendant une nuit (≥ 8 h), le placement des électrodes sous un éclairage rouge dim (17,4 cd.m -2, λ max = 600 nm), et l' adaptation à nouveau sombre suite à un test-éclair dim (10 min pour - 0,52 log cd. sm -2). En outre, les caractéristiques signal-bruit de la STR peuvent être améliorées par une moyenne sur plusieurs signaux (ie, 20 signaux) collectées avec des intervalles inter-relance courts (ie, 2 sec). L' un des avantages de cette évaluation complète des deux yeux et corticales est de permettre la comparaison de l'enregistrement 3 controlatéral. À ce titre, une attention particulière doit être prise dans l' électrode de décision (c. -à- mêmes électrodes de taille et de forme), pour assurer entre les yeux minimal et la variabilité inter-corticale.
Compte tenu de l'utilisation extensive des deux techniques ERG et VEP pour fournir des mesures in vivo de la voie visuelle et de ses processus liés à la maladie, il serait utile de rassembler d' autres p spécifiques voierotocoles (par exemple, ON / OFF ou sous-type conique spécifique), et d' effectuer simultanément des enregistrements ERG / VEP avec différentes modalités de relance (par exemple, le scintillement, le motif, en dents de scie) d'étendre l'application de cette technique dans les diagnostics cliniques. Une autre étape logique de cette application dans le futur serait également enregistrer l'ERG et VEP en même temps que du conscient 29, les animaux librement mobiles pour éviter les influences anesthésiques sur la physiologie neurale 30.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alligator clip | generic brand | HM3022 | Stainless steel 26 mm clip for connecting VEP screw electrodes to cables |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML 135 | For amplifying ERG and VEP signals |
| Carboxymethylcellulose sodium 1.0% | Allergan | CAS 0009000-11-7 | Viscous fluid for improving signal quality of the active ERG electrode |
| Carprofen 0.5% | Pfizer Animal Health Group | CAS 53716-49-7 | Proprietary name: Rimadyl injectable (50 mg/ml). For post-surgery analgesia, diluted to 0.5% (5 mg/ml) in normal saline |
| Chlorhexadine 0.5% | Orion Laboratories | 27411, 80085 | For disinfecting surgical instruments |
| Circulating water bath | Lauda-Königshoffen | MGW Lauda | For maintaining body temperature of the anesthetized animal during surgery and electrophysiological recordings |
| Dental amalgam | DeguDent GmbH | 64020024 | For encasing the electrode-skull assembly to make it more robust |
| Dental burr | Storz Instruments, Bausch and Lomb | #E0824A | A miniature drill head of ~ 0.7 mm diameter for making a small hole in the skull over each hemisphere to implant VEP screws |
| Drill | Bosch | Dremel 300 series | An automatic drill for trepanning |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier |
| Faraday Cage | custom-made | Ensures light proof to maintain dark adaptation. Encloses the Ganzfeld setup to improve signal to noise ratio | |
| Gauze swabs | Multigate Medical Products Pty Ltd | 57-100B | For drying the surgical incision and exposed skull surface during surgery |
| Ganzfeld integrating sphere | Photometric Solutions International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size | |
| Velcro | VELCRO Australia Pty Ltd | VELCRO Brand Reusable Wrap | Hook-and-loop fastener to secure the electrodes and the animal on the recording platform |
| Isoflurane 99.9% | Abbott Australasia Pty Ltd | CAS 26675-46-7 | Proprietary Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for VEP electrode implant surgery |
| Ketamine | Troy Laboratories | Ilium Ketamil | Proprietary name: Ketamil Injection, Brand: Ilium. Pharmaceutical-grade anesthetic for electrophysiological recording |
| Luxeon LEDs | Phillips Lighting Co. | For light stimulation twenty 5 W and one 1 W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the ERG active electrode during recordings |
| Needle electrode | Grass Telefactor | F-E2-30 | Subcutaneously inserted in the tail to serve as the ground electrode for both the ERG and VEP |
| Phenylephrine 2.5% minims | Bausch and Lomb | CAS 61-76-7 | Instilled with Tropicamide to achieve maximal dilation for ERG recording |
| Povidone iodine 10% | Sanofi-Aventis | CAS 25655-41-8 | Proprietory name: Betadine, Antiseptic to prepare the shaved skin for surgery 10%, 500 ml |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML 785 | Controls the LEDs |
| Proxymetacaine 0.5% | Alcon Laboratories | CAS 5875-06-9 | For corneal anaesthesia during ERG recordings |
| Saline solution | Gelflex | Non-injectable, for electroplating silver wire electrodes | |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus via the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make active and inactive ERG electrodes, and the inactive VEP electrode |
| Stainless streel screws | MicroFasterners | 0.7 mm shaft diameter, 3 mm in length to be implanted over the primary visual cortex and serve as the active VEP electrodes | |
| Stereotaxic frame | David Kopf | Model 900 | A small animal stereotaxic instrument for locating the primary visual cortices according to Paxinos & Watson's 2007 rat brain atlas coordinates |
| Surgical blade | Swann-Morton Ltd. | 0206 | For incising the area of skin overlaying the primary visual cortex to implant the VEP electrodes |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co.,Ltd | 3-0 silk braided suture non-absorbable, for skin retraction during VEP electrode implantation surgery | |
| Tobramycine eye ointment 0.3% | Alcon Laboratories | CAS 32986-56-4 | Proprietary name: Tobrex. Prophylactic antibiotic ointment applied around the skin wound after surgery |
| Tropicamide 0.5% | Alcon Laboratories | CAS 1508-75-4 | Proprietary name: 0.5% Mydriacyl eye drop, Instilled to achieve mydriasis for ERG recording |
| Xylazine | Troy Laboratories | Ilium Xylazil-100 | Pharmaceutical-grade anesthetic for electrophysiological recording |
| Pipette tip | Eppendorf Pty Ltd | 0030 073.169 | Eppendorf epTIPS 100 - 5,000 ml, for custom-made electrodes |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | spreadsheet software for data analysis |
| Lethabarb Euthanazia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | LETHA450 | 325 mg/ml pentobarbital sodium for rapid euthanazia |
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