Bestemmelse av Biofilm Initiation på virusinfiserte celler av bakterier og sopp

Summary

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Abstract

Studiet av interaksjonene polymikrobielle på tvers av de taksonomiske riker som omfatter sopp, bakterier og virus er ikke tidligere blitt undersøkt med hensyn til hvordan virale medlemmer av mikrobiomer påvirke etterfølgende mikrobe interaksjoner med disse virus-infiserte vertsceller. Den ko-bolig virus med bakterier og sopp er hovedsakelig til stede på de mucosale overflater i munnhulen og kjønnsorgan. Slimhinneceller, spesielt de med vedvarende kronisk eller vedvarende latente virusinfeksjoner, kan ha en betydelig innvirkning på medlemmer av mikrobiomer gjennom virus endring i antall og type reseptorer uttrykt. Modifikasjon i vertscellemembran arkitektur ville resultere i endrede egenskaper av etterfølgende medlemmer av den normale flora og opportunistiske patogener for å initiere den første trinnet i biofilmdannelse, dvs. tilslutning. Denne studien beskriver en fremgangsmåte for kvantifisering og visuell undersøkelse av HSV virkning på initiering av biofilm dannelse (etterlevelse) av S. aureus og C. albicans.

Introduction

Den menneskelige mikrobiomer omfatter ulike organismer fra flere taksonomiske riker som deler geografiske regioner i kroppen. Overholdelse av celleoverflater er et viktig første skritt i biofilmdannelse, som er en del av mikrobiomer kolonisering prosessen. Inkludert i mikrobiomer kan være virus som forårsaker kroniske og vedvarende infeksjoner. Den kroniske celle infeksjon av disse virusene kan føre til en endring i antatte reseptor tilgjengelighet. ^1,2 I tillegg er celleinntrengning via intracellulære patogener kan også påvirke vert membranfluiditet / hydrofobisitet som igjen kan forandre feste av andre mikrobiomer medlemmer, inklusive bakterier og sopp . For å forstå samspillet som kan oppstå mellom disse flere patogener som co-lokalisere i de samme geografiske områder av den menneskelige vert, må vi være i stand til å studere samspillet mellom patogener som representerer hele spekteret av taksonomiske riker tilstede på slimhinneoverflaten.

t "> The herpesvirus er en familie av mikrober som er tilstede i 100% av menneskene som faste medlemmer av mikrobiomer ^3,4. I tillegg kan de også bli vedvarende felle både i nærvær og fravær av symptomer. Nærmere bestemt, herpes simplex virus-1 og herpes simplex virus-2 (HSV-1 og HSV-2, henholdsvis) er faste medlemmer av mikrobiomer i oronasopharynx og kjønnsorgan. i immun-kompetente individer, både HSV-1 og HSV-2 årsak gingivostomatitis, samt genital herpes ^5-8. på disse områdene, fører til HSV en latent infeksjon preget av kronisk vedvarende asymptomatisk viral Shedding ^9. oppføring av HSV i cellene resulterer i endringer i overflaten uttrykk for nectins, heparansulfat, lipid flåter og herpesvirus oppføring megler / tumor nekrose faktor reseptor (HVEM / TNFR) ^10-25. Disse potensielt representerer felles reseptorer for noen bakterier og sopp, for eksempel S. aureus og C. albicans, som samtidig opportunistiske patogenerkan også ligge som medlemmer av slimhinne mikrobiomer av oronasopharynx ^26,27. Innenfor oronasopharynx S. aureus og C. albicans okkupere to forskjellige områder av kolonisering. I verter med naturlige tenner, er den orale mucosa deles av HSV-1 og C. albicans, mens de fremre nese svelget er okkupert av S. aureus ^28. Men til tross for in vitro funn som S. aureus holder munnen epitelceller, ^29,30 S. aureus er sjelden isolert fra muntlige prøver da normalt vev er til stede ^29,30. Lite er kjent om kjønnsorgan co-kolonisering nisjer utover de kliniske funn som S. aureus er forbundet med aerob vaginitt, karakterisert ved genital inflammasjon, utslipp og dyspareuni, mens C. albicans produserer slimhinnere lignende den som ble observert i munnhulen ^31-35. Derfor, selv om disse medlemmene av den muntlige og genital microbiome kryss taksonomiske riker lite er kjent om deres interaksjon som det påvirker deres evne til å initiere biofilmdannelse gjennom tilslutning til vertscelleoverflaten ^5. Denne protokollen har blitt effektivt brukt til å bestemme de funksjonelle konsekvensene av co-kolonisering / infeksjon.

Protocol

1. HSV Stammer og håndtering Merk: Rekombinant ikke-spredning HSV-1 (KOS) gL86 og HSV-2 (KOS) 333gJ – med beta-galaktosidase reporter aktivitet brukt ble gitt av V. Twiari 36,37. Bruk virus fra en enkelt masse og oppbevar ved -80 ° C ved et 1: 1 forhold av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 20% føtalt bovint serum (FBS) og skummet melk inntil bruk. Før viral masse lagring, bestemme viruskonsentrasjon av o-nitrofenyl-β-D-galaktopyranosid (ONPG) og 5-brom-…

Representative Results

Nivået av robustheten av data som kan oppnås fra systemet som er beskrevet i denne publikasjonen er vist i figur 2 af 38. Ved hjelp av dette systemet modulering av stafylokokk og sopp interaksjon med virusinfiserte celler og deres innvirkning på hverandre tilslutning kan være avgrenset. Disse typer studier krever mikroskopisk undersøkelse av interaksjonen som vist i figurene 3 og 4 38 for å bestemme hvorvidt e…

Discussion

Foreløpig ingen informasjon er tilgjengelig på komplekse interaksjoner mellom permanent til semi-faste medlemmer av verts mikrobiomer som krysser flere taksonomiske domener, dvs. prokaryote, eukaryote og virale. Derfor utviklet vi en roman in vitro modellsystem for å studere biofilm initiering av S. aureus og C. albicans på HSV-1 eller HSV-2-infiserte HeLa-229 (HeLa celler) ^38. Den HeLa cellemodellsystem presenterer en unik fordel. Dette er på grunn av deres mangel på…

Materials

C.albicans
BBL Sabouraud Dextrose	BD	211584
Fungisel Agar	Dot Scientific	7205A
S.aureus
Mannitol Salt Agar	Troy Biologicals	7143B
Sheep blood agar	Troy Biologicals	221239
Hela cells
1xDMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate	Corning	10-017-CM
Gentamicin 50mg/ml	Sigma	1397	50µg/ml final concentration in the complete DMEM
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53M EDTA)Solution 1X	Corning	25-052-CI
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150	10% final concentration in the complete DMEM
Other medium and reagents
ONPG	Thermo Scientific	34055
Ultra-Pure X gal	Invitrogen	15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution)	Corning	20-021-CV
1XPBS	Dot Scientific	30042-500
RIPA Lysis	Life Technologies	89901
Staining
Methanol	Fisher Scientific	A433P-4
HSV 1&2, specific for gD	ViroStat	196
DAPI	SIGMA	D8417-5MG
Gram Crystal Violet	Troy Biologicals	212527
Supplies
Petri dish 100X15	Dot Scientific	229693
Petri dish 150X15	Kord Valmark	2902
96-Well plates	Evergreen Scientific	222-8030-01F
24-well plates	Evergreen Scientific	222-8044-01F
Culture tubes 100×13	Thomas Scientific	9187L61
Cover slip circles, 12mm	Deckglaser	CB00120RA1