JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
면역학 및 감염병학

تحديد بيوفيلم بدء في الخلايا المصابة بالفيروسات من قبل البكتيريا والفطريات

Published: July 06, 2016
doi:
10.3791/54162
, , ,
1Department of Microbiology and Immunology,Midwestern University

Summary

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Abstract

دراسة التفاعلات متعدد المكروبات في جميع أنحاء الممالك التصنيفية التي تشمل البكتيريا والفطريات والفيروسات لم تفحص سابقا في ما يتعلق بكيفية أعضاء الفيروسي من microbiome يؤثر على التفاعلات ميكروب لاحقة مع الخلايا المضيفة المصابة بالفيروسات هذه. والعيش المشترك بين الفيروس مع البكتيريا والفطريات موجودة أساسا على الأسطح المخاطية لتجويف الفم والجهاز التناسلي. خلايا الغشاء المخاطي، ولا سيما مع العدوى الفيروسية الكامنة المزمنة أو الدائمة المستمرة، يمكن أن يكون له تأثير كبير على أعضاء microbiome من خلال تغيير الفيروس في عدد ونوع من المستقبلات التي أعرب عنها. أن التعديل في العمارة غشاء الخلية المضيفة يؤدي إلى القدرة غيرت من أعضاء لاحق من النباتات الطبيعية ومسببات الأمراض الانتهازية لبدء الخطوة الأولى في تشكيل بيوفيلم، أي التزام. توضح هذه الدراسة وسيلة لتحديد الكميات والفحص البصري للتأثير HSV على بدء biofilتشكيل م (الالتزام) س الذهبية وجيم البيض.

Introduction

يتضمن microbiome الإنسان الكائنات الحية المتنوعة من الممالك التصنيفية المتعددة التي تتقاسم مناطق جغرافية في الجسم. التمسك سطوح الخلايا هو خطوة أولى أساسية في تشكيل بيوفيلم، الذي هو جزء من عملية microbiome الاستعمار. وشملت في microbiome يمكن أن تكون الفيروسات التي تسبب الالتهابات المزمنة والمستمرة. عدوى الخلايا المزمن من قبل هذه الفيروسات يمكن أن تسبب تغيير في توفر مستقبلات المفترض 1،2 بالإضافة إلى ذلك، دخول الخلية عن طريق الجراثيم داخل الخلايا يمكن أن تؤثر أيضا على غشاء المضيف سيولة / للا مائية والتي بدورها قد يغير الحجز على أعضاء microbiome الآخرين، بما في ذلك البكتيريا والفطريات . من أجل فهم التفاعلات التي تحدث بين هذه الجراثيم المتعددة التي شاركت في توطين في مناطق جغرافية واحدة للمضيف البشري، يجب أن نكون قادرين على دراسة التفاعل من مسببات الأمراض التي تمثل طائفة من الممالك التصنيفية الحاضرة في سطح الغشاء المخاطي.

ر "> إن فيروسات هربسية هي عائلة من الميكروبات الموجودة في 100٪ من البشر كأعضاء دائمين في microbiome 3،4. وبالإضافة إلى ذلك يمكن أيضا أن تسلط باستمرار سواء في وجود وعدم وجود أعراض وعلى وجه التحديد، فيروس العقبول البسيط-1 وفيروس العقبول البسيط 2 (HSV-1 و HSV-2، على التوالي) أعضاء الدائمين في microbiome في oronasopharynx والجهاز التناسلي. في الأفراد المناعة المختصة، سواء HSV-1 و HSV-2 سبب التهاب اللثة، وكذلك الهربس التناسلي 5-8. في هذه المواقع، HSV يسبب العدوى الكامنة التي تتميز المزمن المستمر بدون أعراض الفيروسية تسليط 9. دخول HSV إلى نتائج الخلايا في إحداث تغييرات في التعبير سطح nectins، كبريتات heparan، الطوافات الدهنية وهربس دخول الوسيط نخر الورم / مستقبلات عامل (HVEM / TNFr) 10-25. هذه المستقبلات يحتمل أن تمثل المشتركة لبعض البكتيريا والفطريات، مثل بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية وجيم البيض، في حين أن الذي مسببات الأمراض الانتهازية،ويمكن أيضا أن يقيم كأعضاء في microbiome المخاطية للoronasopharynx 26،27. ضمن oronasopharynx س. الذهبية وجيم البيض تحتل موقعين متميزين من الاستعمار. في المضيفين مع الأسنان الطبيعية، ويشارك في الغشاء المخاطي للفم من قبل HSV-1 و C. البيض، في حين احتلت فتحتي الأنف الأنف الأمامية التي كتبها س. الذهبية 28. ومع ذلك، على الرغم من في المختبر النتائج أن S. الذهبية تلتزم الخلايا الظهارية الفم، 29،30 س. يتم عزل الذهبية نادرا من العينات عن طريق الفم عندما الأنسجة الطبيعية موجودة 29،30. ولا يعرف سوى القليل بشأن منافذ الجهاز المشارك الاستعمار التناسلية وراء النتائج السريرية التي S. ويرتبط الذهبية مع التهاب المهبل الهوائية، ويتميز بالتهاب الأعضاء التناسلية والتفريغ وعسر الجماع، بينما C. البيض تنتج الآفات المخاطية مماثلة لتلك التي لوحظت في تجويف الفم 31-35. وهكذا، على الرغم من أن هؤلاء الأعضاء من microbi عن طريق الفم والأعضاء التناسليةلى بعد الممالك التصنيفية عبر يعرف المتعلقة تفاعلها قليلا لأنه يؤثر قدرتها على الشروع في تشكيل بيوفيلم من خلال الانضمام إلى سطح الخلية المضيفة 5. وقد تم تطبيق هذا البروتوكول على نحو فعال لتحديد عواقب وظيفية المشترك الاستعمار / العدوى.

Protocol

1. HSV سلالات والمناولة ملاحظة: المؤتلف غير نشر HSV-1 (كوس) gL86 وHSV-2 (كوس) 333gJ – مع النشاط مراسل بيتا غالاكتوزيداز المستخدمة قدمتها خامسا Twiari 36،37. استخدام الفيروس من الكثير واحد ومخزن في -80…

Representative Results

يظهر مستوى متانة البيانات التي يمكن الحصول عليها من النظام المذكور في هذا التقرير في الشكل 2 AF 38. من خلال استخدام هذا النظام لتعديل من التفاعل المكورات العنقودية والفطرية مع الخلايا المصابة فيروسي وتأثيرها على التزام كل منهما ويمكن ت…

Discussion

حاليا يتوفر على التفاعلات المعقدة بين الأعضاء الدائمين وشبه دائم في microbiome المضيفة التي تعبر متعددة المجالات التصنيفية، أي بدائيات النوى، حقيقيات النوى والفيروسية أية معلومات. لذلك وضعنا رواية في نظام نموذجي المختبر لدراسة بدء بيوفيلم من قبل س…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).

Materials

C.albicans
BBL Sabouraud Dextrose BD 211584
Fungisel Agar Dot Scientific 7205A
S.aureus
Mannitol Salt Agar Troy Biologicals 7143B
Sheep blood agar Troy Biologicals 221239
Hela cells
1xDMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate Corning 10-017-CM
Gentamicin 50mg/ml Sigma 1397 50µg/ml final concentration in the complete DMEM
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53M EDTA)Solution 1X Corning 25-052-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150 10% final concentration in the complete DMEM
Other medium and reagents
ONPG Thermo Scientific 34055
Ultra-Pure X gal Invitrogen 15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) Corning 20-021-CV
1XPBS Dot Scientific 30042-500
RIPA Lysis Life Technologies 89901
Staining
Methanol Fisher Scientific A433P-4
HSV 1&2, specific for gD ViroStat 196
DAPI SIGMA D8417-5MG
Gram Crystal Violet Troy Biologicals 212527
Supplies
Petri dish 100X15 Dot Scientific 229693 
Petri dish 150X15 Kord Valmark 2902
96-Well plates Evergreen Scientific 222-8030-01F
24-well plates Evergreen Scientific 222-8044-01F
Culture tubes 100×13 Thomas Scientific 9187L61
Cover slip circles, 12mm Deckglaser CB00120RA1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palu, G., et al. Effects of herpes-simplex virus type-1 infection on the plasma-membrane and related functions of HeLa S3 cells. J Gen Virol. 75, 3337-3344 (1994).
  2. Vitiello, G., et al. Lipid composition modulates the interaction of peptides deriving from herpes simplex virus type I glycoproteins B and H with biomembranes. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1808, 2517-2526 (2011).
  3. Bradley, H., Markowitz, L. E., Gibson, T., McQuillan, G. M. Seroprevalence of Herpes Simplex Virus Types 1 and 2-United States, 1999-2010. J. Infect. Dis. 209, 325-333 (2014).
  4. Szpara, M. L., et al. Evolution and diversity in Human Herpes Simplex Virus genomes. J Virol. 88, 1209-1227 (2014).
  5. Arduino, P. G., Porter, S. R. Herpes Simplex Virus Type I infection: overview on relevant clinico-pathological features. J Oral Pathol Med. 37, 107-121 (2008).
  6. Looker, K. J., Garnett, G. P. A systematic review of the epidemiology and interaction of herpes simplex virus types 1 and 2. Sex. Transm. Infect. 81, 103-107 (2005).
  7. Taylor, T. J., Brockman, M. A., McNamee, E. E., Knipe, D. M. Herpes simplex virus. Front Biosci. 7, 752-764 (2002).
  8. Bernstein, D. I., et al. Epidemiology, clinical presentation, and antibody response to primary infection with Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2 in young women. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 56, 344-351 (2013).
  9. Sacks, S. L., et al. HSV shedding. Antiviral Res. 63, 19-26 (2004).
  10. Brandhorst, T. T., et al. Structure and Function of a Fungal Adhesin that Binds Heparin and Mimics Thrombospondin-1 by Blocking T Cell Activation and Effector Function. PLoS Pathog. 9, (2013).
  11. Green, J. V., et al. Heparin-Binding Motifs and Biofilm Formation by Candida albicans. Journal of Infectious Diseases. 208, 1695-1704 (2013).
  12. Khalil, M. A., Sonbol, F. I. Investigation of biofilm formation on contact eye lenses caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus. Niger. J. Clin. Pract. 17, 776-784 (2014).
  13. Shanks, R. M. Q., et al. Heparin stimulates Staphylococcus aureus biofilm formation. Infection and Immunity. 73, 4596-4606 (2005).
  14. Tiwari, V., et al. Role for 3-O-sulfated heparan sulfate as the receptor for herpes simplex virus type 1 entry into primary human corneal fibroblasts. J Virol. 80, 8970-8980 (2006).
  15. Delboy, M. G., Patterson, J. L., Hollander, A. M., Nicola, A. V. Nectin-2-mediated entry of a syncytial strain of herpes simplex virus via pH-independent fusion with the plasma membrane of Chinese hamster ovary cells. Virol J. 3, (2006).
  16. Di Giovine, P., et al. Structure of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1. PLoS Pathog. 7, (2011).
  17. Hauck, C. R. Cell adhesion receptors – signaling capacity and exploitation by bacterial pathogens. Medical Microbiology and Immunology. 191, 55-62 (2002).
  18. Kramko, N., et al. Early Staphylococcus aureus-induced changes in endothelial barrier function are strain-specific and unrelated to bacterial translocation. Int. J. Med. Microbiol. 303, 635-644 (2013).
  19. Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Molecular vision. 17, 3166-3174 (2011).
  20. Sato, R., et al. Impaired cell adhesion, apoptosis, and signaling in WASP gene-disrupted Nalm-6 pre-B cells and recovery of cell adhesion using a transducible form of WASp. Int. J. Hematol. 95, 299-310 (2012).
  21. Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-alpha in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2878-2887 (2009).
  22. Stump, J. D., Sticht, H. Mutations in herpes simplex virus gD protein affect receptor binding by different molecular mechanisms. J Molecu Model. 20, (2014).
  23. Zelano, J., Wallquist, W., Hailer, N. P., Cullheim, S. Expression of nectin-1, nectin-3, N-cadherin, and NCAM in spinal motoneurons after sciatic nerve transection. Experimental Neurology. 201, 461-469 (2006).
  24. Akhtar, J., et al. HVEM and nectin-1 are the major mediators of herpes simplex virus 1 (HSV-1) entry into human conjunctival epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 4026-4035 (2008).
  25. Heo, S. K., et al. LIGHT enhances the bactericidal activity of human monocytes and neutrophils via HVEM. J. Leukoc. Biol. 79, 330-338 (2006).
  26. . National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report. Am J Infect Control. 32, 470-485 (2004).
  27. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 39, 1093-1093 (2004).
  28. Colacite, J., et al. Pathogenic potential of Staphylococcus aureus strains isolated from various origins. Ann. Microbiol. 61, 639-647 (2011).
  29. Colombo, A. V., et al. Quantitative detection of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa in human oral epithelial cells from subjects with periodontitis and periodontal health. J. Med. Microbiol. 62, 1592-1600 (2013).
  30. Merghni, A., Ben Nejma, M., Hentati, H., Mahjoub, A., Mastouri, M. Adhesive properties and extracellular enzymatic activity of Staphylococcus aureus strains isolated from oral cavity. Microb Pathogen. 73, 7-12 (2014).
  31. Donders, G. G. G., et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. Bjog. 109, 34-43 (2002).
  32. Li, J. R., McCormick, J., Bocking, A., Reid, G. Importance of vaginal microbes in reproductive health. Repro Sci. 19, 235-242 (2012).
  33. Jarvis, W. R. The epidemiology of colonization. Infect Cont Hosp Epidemiol. 17, 47-52 (1996).
  34. Okonofua, F. E., Akonai, K. A., Dighitoghi, M. D. Lower genital-tract infections in infertile nigerian women compared with controls. Genitourin Med. 71, 163-168 (1995).
  35. Nenoff, P., et al. Mycology – an update Part 2: Dermatomycoses: Clinical picture and diagnostics. J Der Deutschen Dermatol Gesellschaft. 12, 749-779 (2014).
  36. Hubbard, S., et al. Contortrostatin, a homodimeric disintegrin isolated from snake venom inhibits herpes simplex virus entry and cell fusion. Antivir. Ther. 17, 1319-1326 (2012).
  37. Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-α in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50, 2878-2887 (2009).
  38. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Herpes simplex virus (HSV) modulation of Staphylococcus aureus. and Candida albicans.initiation of HeLa 299 cell-associated biofilm. Curr Microbiol. , (2016).
  39. Alva-Murillo, N., Lopez-Meza, J. E., Ochoa-Zarzosa, A. Nonprofessional phagocytic cell receptors involved in Staphylococcus aureus internalization. Biomed Res Internat. , (2014).
  40. Calderone, R. A., Scheld, W. M. Role of fibronectin in the pathogenesis of candidal infections. Reviews of infectious diseases. 9, 400-403 (1987).
  41. Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European journal of cell biology. 79, 672-679 (2000).
  42. Mao, L., Franke, J. Symbiosis, dysbiosis, and rebiosis-The value of metaproteomics in human microbiome monitoring. Proteomics. 15, 1142-1151 (2015).
  43. Christopher, R. A., Kowalczyk, A. P., McKeown-Longo, P. J. Localization of fibronectin matrix assembly sites on fibroblasts and endothelial cells. J Cell Sci. 110, 569-581 (1997).
  44. Heino, J., Kapyla, J. Cellular receptors of extracellular matrix molecules. Current Pharm Des. 15, 1309-1317 (2009).
  45. Hynes, R. O., et al. A large glycoprotein lost from the surfaces of transformed cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 312, 317-342 (1978).
  46. Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology. 24, 389-399 (2005).
  47. Schwarzbauer, J. E., DeSimone, D. W. Fibronectins, their fibrillogenesis, and in vivo functions. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
  48. Abdelmegeed, E., Shaaban, M. I. Cydooxygenase inhibitors reduce biofilm formation and yeast-hypha conversion of fluconazole resistant Candida albicans. J. Microbiol. 51, 598-604 (2013).
  49. Gow, N. A. Germ tube growth of Candida albicans. Current topics in medical mycology. 8, 43-55 (1997).
  50. Liu, Y. P., Filler, S. G. Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryot. Cell. 10, 168-173 (2011).
  51. Lu, Y., Su, C., Liu, H. Candida albicans hyphal initiation and elongation. Trends Microbiol. 22, 707-714 (2014).
  52. Kabir, M. A., Hussain, M. A., Ahmad, Z. Candida albicans: A model organism for studying fungal pathogens. ISRN microbiology. 2012, 538694 (2012).
  53. Ovchinnikova, E. S., Krom, B. P., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Evaluation of adhesion forces of Staphylococcus aureus along the length of Candida albicans hyphae. BMC Microbiol. 12, (2012).
  54. Peters, B. M., et al. Staphylococcus aureus adherence to Candida albicans hyphae is mediated by the hyphal adhesin Als3p. Microbiology-Sgm. 158, 2975-2986 (2012).

Tags

Keywords: BiofilmViral InfectionOpportunistic PathogensStaphylococcus AureusCandida AlbicansHSVCMVAdenovirusHeLa CellsC. AlbicansGerm TubeYeast FormAdherenceAttachmentMicrobiomeMultiplicity Of InfectionReporter VirusParaformaldehyde GlutaraldehydeDMEMTrypsinHBSSOD 600
check_url/kr/54162?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image