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Summary
Abstract
Introduction
Protocol
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면역학 및 감염병학

細菌や真菌によってウイルス感染細胞上のバイオフィルムの開始の決意

Published: July 06, 2016
doi:
10.3791/54162
, , ,
1Department of Microbiology and Immunology,Midwestern University

Summary

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Abstract

真菌、細菌やウイルスを含む分類学上の王国全体で複数菌相互作用の研究は、以前microbiomeのウイルスのメンバーは、これらのウイルスに感染した宿主細胞とそれに続く微生物相互作用をどのように影響するかに関して検討されていません。細菌および真菌とのウイルスの共居住は、主に口腔及び生殖管の粘膜表面上に存在します。粘膜細胞、持続性の慢性または持続性ウイルス潜伏感染症、特にものは、発現された受容体の数とタイプでウイルス改変を通じてmicrobiomeのメンバーに重大な影響を与える可能性があります。宿主細胞膜のアーキテクチャの変更は、バイオフィルム形成の最初のステップを開始するための正常細菌叢と日和見病原体のその後のメンバーの変更された能力、 すなわち 、密着性をもたらすであろう。この研究は、biofilの開始時にHSVの効果の定量化および目視検査のための方法を説明しS.のm個の形成（付着） aureusおよびC.アルビカンス 。

Introduction

人間microbiomeは、体内の地理的領域を共有する複数の分類学上の王国からの多様な生物が含まれます。細胞表面への付着はmicrobiomeの植民地化プロセスの一部であるバイオフィルム形成に不可欠な最初のステップです。 microbiomeに含まれては、慢性かつ持続的な感染症を引き起こすウイルスであることができます。これらのウイルスによる慢性細胞感染は推定受容体の可用性における変化を引き起こす可能性があります。また1,2、細胞内病原体による細胞エントリも順番に細菌や真菌などの他のmicrobiomeメンバーの添付ファイルを、変更することができるホスト膜流動性/疎水性に影響を与える可能性があります。ヒト宿主の同じ地域に共局在これらの複数の病原体との間で発生する可能性があります相互作用を理解するために、我々は、粘膜表面に存在する分類学上の王国のスペクトルを表し、病原体の相互作用を研究することができなければなりません。

tは">ヘルペスウイルスはmicrobiome 3,4の永久的なメンバーとしてのヒトの100％に存在する微生物のファミリーである。加えて、それらはまた、永続的両方の症状の存在下および非存在下で流すことができる。具体的には、単純ヘルペスウイルス1および単純ヘルペスウイルス2（HSV-1およびHSV-2、それぞれ）HSV-1およびHSV-2の原因の歯肉口内炎の両方、免疫適格個体で。oronasopharynx及び生殖管におけるmicrobiomeの永久的なメンバーであるだけでなく、性器ヘルペス5-8。これらのサイトでは、HSVは、慢性持続nectins、ヘパラン硫酸、脂質ラフトとヘルペスウイルスエントリーメディエーターの表面発現の変化における細胞の結果にHSVの9。エントリを流しウイルス無症候性/腫瘍壊死によって特徴づけ潜伏感染を引き起こします因子受容体（HVEM / TNFR）10月25日 。これらは、潜在的に日和見病原体ながら、いくつかの細菌および真菌のための共有の受容体を表す例えば黄色ブドウ球菌およびカンジダ・アルビカンス、これ、またoronasopharynx 26,27の粘膜microbiomeのメンバーとして常駐することができます。 oronasopharynx S.内aureusおよびC.アルビカンスは植民地化のの2つの異なる部位を占めます。天然歯を持つホストでは、口腔粘膜は、HSV-1およびCによって共有されていますアルビカンス、前部鼻鼻孔はS.によって占有されている間黄色ブドウ球菌 28。しかし、にもかかわらず、in vitroでの知見そのS.黄色ブドウ球菌は、口腔上皮細胞に付着し、29,30 S.正常組織29,30存在する場合球菌はまれ経口標本から単離されます。リトルは、臨床所見ものを超える生殖管の共同植民地化のニッチについて知られているS.黄色ブドウ球菌は C.ながら、性器の炎症、放電および性交疼痛症によって特徴づけられる、好気性膣炎に関連していますアルビカンスは、口腔31〜35で観察されたものと同様の粘膜の病変を生成します。このように、経口および生殖器microbiのこれらのメンバーが、分類学的王国少しOMEクロスは、宿主細胞表面5への接着を介してバイオフィルムの形成を開始することが影響能力としてのそれらの相互作用について知られています。このプロトコルは、効果的に、共コロニー形成/感染の機能的結果を判定するために適用されています。

Protocol

1. HSV株及び取扱い注：組換え非拡散HSV-1（KOS）gL86およびHSV-2（KOS）333gJを- V. Twiari 36,37によって提供された使用β-ガラクトシダーゼレポーター活性を有します。 1で-80℃での単一のロットとストアからウイルスを使用してください：20％ウシ胎児血清（FBS）とダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の1の比率、使用するまでスキムミルク。ウイルスロット保存前、 …

Representative Results

このレポートに記載されているシステムから得られるデータの堅牢性のレベルは、 図2のaf 38に示されています。このシステムを使用することによりウイルス感染細胞や互いの密着性に及ぼす影響とブドウ球菌と真菌の相互作用の変調が描写することができます。多菌相互作用が同じ細胞で発生しているかどうかを決定するために、 図3</stron…

Discussion

現在のところ情報は、原核生物、真核生物およびウイルスの複数の分類学上のドメイン、 すなわち 、交差ホストmicrobiomeの半永久的なメンバーに永久の間の複雑な相互作用に利用できません。したがって、我々はSでバイオフィルムの開始を研究するためのインビトロモデルシステムで小説を開発しましたaureusおよびC. HSV-1またはHSV-2上アルビカンス?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).

Materials

C.albicans
BBL Sabouraud Dextrose BD 211584
Fungisel Agar Dot Scientific 7205A
S.aureus
Mannitol Salt Agar Troy Biologicals 7143B
Sheep blood agar Troy Biologicals 221239
Hela cells
1xDMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate Corning 10-017-CM
Gentamicin 50mg/ml Sigma 1397 50µg/ml final concentration in the complete DMEM
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53M EDTA)Solution 1X Corning 25-052-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150 10% final concentration in the complete DMEM
Other medium and reagents
ONPG Thermo Scientific 34055
Ultra-Pure X gal Invitrogen 15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) Corning 20-021-CV
1XPBS Dot Scientific 30042-500
RIPA Lysis Life Technologies 89901
Staining
Methanol Fisher Scientific A433P-4
HSV 1&2, specific for gD ViroStat 196
DAPI SIGMA D8417-5MG
Gram Crystal Violet Troy Biologicals 212527
Supplies
Petri dish 100X15 Dot Scientific 229693 
Petri dish 150X15 Kord Valmark 2902
96-Well plates Evergreen Scientific 222-8030-01F
24-well plates Evergreen Scientific 222-8044-01F
Culture tubes 100×13 Thomas Scientific 9187L61
Cover slip circles, 12mm Deckglaser CB00120RA1
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References

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Keywords: BiofilmViral InfectionOpportunistic PathogensStaphylococcus AureusCandida AlbicansHSVCMVAdenovirusHeLa CellsC. AlbicansGerm TubeYeast FormAdherenceAttachmentMicrobiomeMultiplicity Of InfectionReporter VirusParaformaldehyde GlutaraldehydeDMEMTrypsinHBSSOD 600
check_url/kr/54162?article_type=t

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Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).
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