Dijbeen Window Chamber Model voor<em> In Vivo</em> Cell Tracking in het Muizen Bone Marrow
Summary
The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.
Abstract
Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.
Introduction
Beenmerg is een belangrijk orgaan betrokken bij hematopoiese en immuun regelgeving. Het bestaat uit een bestanddeel dat hematopoietische stamcellen en hematopoietische progenitorcellen (HSPCs) en een stromale component met niet-hematopoietische stamcellen die aanleiding geven tot mesenchymale cellen 1. Tweederde van hematopoietische activiteit is gewijd aan het genereren van myeloïde cellen 2. Vooral een groot aantal neutrofielen geproduceerd in het beenmerg, met 1-2 x 10 11 cellen per dag gegenereerd in een normaal volwassen mens 2. Neutrofielen zijn de eerste verdedigingslinie tegen microbiële infecties en zijn meestal gereserveerd in het beenmerg tot stress-triggers hun mobilisatie van perifere neutrofielen 1,3 vullen. Naast hun antimicrobiële effecten, suggereren recente studies een belangrijke rol van neutrofielen in kankerbiologie heeft zowel pro- als anti-tumorigene fenotype afhankelijk transforming growthfactor beta (TGF-β) signalering in de tumor micro 4,5. Bovendien hebben onderzoeken aangetoond dat neutrofielen die accumuleren in primaire tumoren uitoefenen pro-tumorigene en metastatische effect van onderdrukken van de cytotoxische functie van T-cellen 6,7, terwijl neutrofielen in omloop oefenen een cytotoxische anti-metastatisch effect 8. Als zodanig onderzoek hematopoietische cellen in het beenmerg, met name neutrofielen, is cruciaal voor het ophelderen van hun rol bij immuun en tumor regelgeving.
Histopathologie en volledig perifeer bloedbeeld worden routinematig gebruikt om cellulaire en structurele veranderingen in het beenmerg 9 evalueren. Echter, deze methoden leveren alleen statische informatie van verschillende celpopulaties of weefsel microstructuren. Longitudinale in vivo beeldvorming kan worden gebruikt in combinatie met standaardmethoden om de dynamiek van meerdere cellulaire en vasculaire stromale componenten en beoordeelt cel-Cell interacties in een longitudinale wijze. Intravitale microscopie (IVM), gedefinieerd als beeldvorming van levende dieren bij microscopische resolutie van 10, is met name handig voor de beoordeling van dynamische cellulaire processen in de tijd in hetzelfde monster, vermindering van het aantal proefdieren nodig. IVM wordt vaak gecombineerd met een chronisch getransplanteerde venster kamer (WC) om het betreffende orgaan voor beeldvorming over een periode van weken tot maanden. Cranial en dorsale-huidplooi WC-modellen hebben de langste geschiedenis van gebruik teruggaat tot het midden van de jaren 1990. Meer recent zijn andere orgaanspecifieke WC modellen zoals die van de uiervet pad en verschillende buikorganen ontwikkeld 11.
De typische aanpak voor het afbeelden van het beenmerg in vivo heeft voornamelijk bezig blootstelling van het schedeldak van muizen, waarbij de verdunde bot maakt directe visualisatie van afzonderlijke cellen met een minimale chirurgische ingreep 12-14. Echter de calvarial beenmerg be verschillend van die van andere botten, zoals de lange botten, hetgeen blijkt uit een lager aantal HSPCs en hypoxische cellen calvaria, aanduidt, minder onderhoud en de ontwikkeling van HSPCs 15. Daarom zijn alternatieve werkwijzen om de cellulaire componenten in het pijpbeen onderzocht. Deze omvatten directe blootstelling van de femorale beenmerg 16 en buitenbaarmoederlijke transplantatie van split dijbeen in de dorsale huidplooi WC 17. De eerste is een terminal procedure die niet volgen van cellulaire structurele en functionele veranderingen toelaat gedurende langere perioden, en deze waarschijnlijk verstoort normale beenmergfunctie door de transplantatie van dijbeen een ectopische plaats in het dorsale huidplooi WC. Een andere methode die orthotope seriële beeldvorming van femorale beenmerg maakt de tijd is het gebruik van een toilet in het dijbeen. Een vorige verslag aangetoond op lange termijn beeldvorming van de microcirculatie in het dijbeen beenmerg met behulp van eenfemur WC in muizen 18. Bovendien, de auteurs aangetoond visualisatie van tumorcellen in het dijbeen met vermelding van de bruikbaarheid in controle beenmerg metastase. Dit was echter WC ontwerp beperkt door zijn grote omvang (1,2 cm diameter) en relatief kleine opnamegebied (4 mm diameter), die alleen voor grote muizen (26-34 g, 3-6 maanden oud) werd aldus het benadering onpraktisch voor routinegebruik.
Derhalve een nieuw toilet met een kleinere totale afmeting en grotere binnendiameter opnamegebied is ontworpen voor het doel van deze studie. Het doel van deze studie was om een werkwijze voor het afbeelden van verschillende celtypes in de femorale beenmerg verschaffen. Het dijbeen WC model werd in eigen huis ontwikkeld en werd gebruikt om neutrofielen te visualiseren en te volgen binnen het 3D-vasculaire netwerk. Met behulp van dit model, kan IVM van het beenmerg in serie worden uitgevoerd over 40 dagen. Deze benadering kan worden toegepast op verschillende gebieden voor het ophelderen van de processen van hematopoiese, immuunregulatie eennd de ontwikkeling van tumoren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Real-time, seriële beeldvorming van de dynamische cellulaire processen in het beenmerg bevat informatie die anders is een uitdaging voor het verkrijgen van het gebruik van conventionele technieken, zoals histologie en totale bloedbeeld. Het dijbeen WC model hier beschreven biedt unieke mogelijkheden om cellulaire en structurele veranderingen in het beenmerg te onderzoeken in de tijd. Hoewel een femur WC model hiervoor vermeld, ons nieuwe ontwerp dat een grotere imaging gezichtsveld en kleinere totale WC grootte, die me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de Advanced Optical Microscopy Facility (www.aomf.ca) van de Universiteit Health Network bedanken voor de hulp bij microscopie, en de heer Jason Ellis van het Princess Margaret Cancer Center Machine Shop voor het vervaardigen van de WC en de imaging podium. We willen ook graag bedanken Dr. Iris Kulbatski voor manuscript bewerken.
Materials
| NRCNU-F athymic nude mice | Taconic | Ncr nude | 8-10 weeks old, female |
| Saline | Baxter | JB1302P | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Surgical drape | Proxima | DYNJP2405 | |
| Electric heating pad | Life Brand | 57800827375 | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M60 | |
| Eye ointment (tear gel) | Novartis | T296/2 | |
| 7.5% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-151-16 | |
| 70% isopropyl alcohol | GreenField | P010IP7P | |
| 10% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-150-05 | |
| Scalpel handle (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blade (#15) | VWR | 89176-368 | |
| Spring Scissors curved | Fine science Tools | 15023-10 | |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine science Tools | 13013-14 | |
| Fine Scissors | Fine science Tools | 14094-11 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine science Tools | 11151-10 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | Fine science Tools | 13008-12 | |
| Micro-drill | Harvard Apparaus | 72-6065 | |
| Micro-drill burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | |
| Femur window chamber | PMCC machine shop | custom design | 9.1mm- 8.5mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9mm (distance between two holes), 0.7mm (thickness) |
| U-shaped bar | PMCC machine shop | custom design | 13.8mm (length), 1.6 mm (width), 3.7mm (height) |
| Coverglass (8mm) | Warner Instruments | HBIO 64-0701 CS-8R | |
| Retaining ring (8mm) | ACKLANDS GRAINGER | UNSPSC # 31163202 | |
| Nuts (hexagon stainless steel) | Fastenal | 70701 | |
| Dental cement | 3M | RelyX U200 | |
| Suture (5-0 Monosof black) | Covioien | SN-5698 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12501-13 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Reckitt Benckiser | DIN 0281251 | |
| Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim | DIN 02240463 | |
| Amoxicillin (Clamavox) | Pfizer | DIN 02027879 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD2000S | |
| APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) | eBioscience | 17-9668 | |
| Two-photon microscope LSM 710 | Carl Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | |
| Imaging stage | PMCC machine shop | custom design | 15.9cm (length), 11cm (width), 0,9cm (height) |
| Imaris software | Bitplane | Imaris 8.0 | Image analysis software described in Section 3 of the Protocol |
| Zen 2012 | Zeiss | Zen 2012 | Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol |
References
- Zhao, E., et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. Tumor-associated neutrophils: friend or foe?. Carcinogenesis. , (2012).
- Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: ‘N1’ versus ‘N2 TAN. Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).
- Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).
- Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging. IntraVital. 3 (2), e29917 (2014).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. (96), e52476 (2015).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1. J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow. J. Vis. Exp. (91), e51683 (2014).
- Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).
- Balan, M., Kiefer, F. A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs. IntraVital. 4 (2), e1066949 (2015).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Femur window–a new approach to microcirculation of living bone in situ. J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).
- Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296 (2011).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Bucher, K., et al. Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice. J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), (2013).
- Koewler, N. J., et al. Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur. J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M., Singh, S. R., Coppola, V. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. 1194, 289-312 (2014).
