Femore finestra del modello Camera per<em> In Vivo</em> Monitoraggio delle cellule nel midollo osseo murino

Summary

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Abstract

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Introduction

Il midollo osseo è un importante organo coinvolto nella emopoiesi e regolazione immunitaria. Si compone di un componente ematopoietiche contenente cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPCs), e una componente stromale che contiene cellule progenitrici ematopoietiche non che danno origine a cellule mesenchimali ^1. Due terzi di attività ematopoietiche è dedicato alla generazione di cellule mieloidi ^2. In particolare, un gran numero di neutrofili sono prodotte nel midollo osseo, con 1-2 x 10 ¹¹ cellule generate al giorno in un normale umano adulto ^2. I neutrofili sono la prima linea di difesa contro le infezioni microbiche e sono per lo più riservati nel midollo osseo fino lo stress innesca la loro mobilitazione per integrare i neutrofili periferici ^1,3. Oltre ai loro effetti anti-microbici, studi recenti suggeriscono un ruolo importante dei neutrofili in biologia del cancro, avendo entrambi pro e fenotipi anti-cancerogeni a seconda della crescita trasformandofattore beta (TGF-β) di segnalazione nel ^4,5 microambiente tumorale. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che i neutrofili che si accumulano nei tumori primari esercitano effetti pro-cancerogeni e metastatici sopprimendo la funzione citotossica delle cellule T ^6,7, mentre i neutrofili in circolazione esercitano un citotossico, effetto anti-metastatico ^8. Come tale, ricerca di cellule ematopoietiche del midollo osseo, in particolare neutrofili, è fondamentale per chiarire il loro ruolo nella regolazione immunitaria e tumore.

Istopatologia e un conteggio completo del sangue periferico sono abitualmente utilizzati per valutare le alterazioni cellulari e strutturali nel midollo osseo ^9. Tuttavia, questi metodi forniscono solo informazioni statiche di diverse popolazioni cellulari o tissutali microstrutture. Longitudinale imaging in vivo può essere utilizzato in combinazione con i metodi standard per valutare le dinamiche di molteplici componenti cellulari, vascolari e stromali e cellula-cinterazioni ell in modo longitudinale. Microscopia intravitale (IVM), definito come l'imaging di animali vivi con risoluzione microscopica ^10, è particolarmente utile per valutare i processi cellulari dinamici nel tempo nello stesso campione, riducendo il numero di animali sperimentali richiesto. IVM è spesso combinato con una camera di finestra cronicamente trapiantato (WC) per accedere al organo di interesse per l'imaging su una durata di settimane o mesi. modelli WC cranici e dorsale-plica hanno la più lunga storia di utilizzo che risale alla metà degli anni 1990. Più recentemente, altri modelli WC organo-specifiche, quali quelle del pad grasso mammario e vari organi addominali sono stati sviluppati ^11.

L'approccio tipico per l'imaging del midollo osseo in vivo ha l'esposizione occupa principalmente della calvaria di topi, dove l'osso assottigliata permette la visualizzazione diretta di singole cellule con un intervento chirurgico minimo ^12-14. Tuttavia, il midollo osseo cranica May Be distinto da quello di altre ossa, come l'osso lungo, come dimostrato da un numero inferiore di HSPCs e cellule ipossiche in calvaria, che indica ridotta manutenzione e lo sviluppo HSPCs ^15. Pertanto, approcci alternativi per la valutazione componenti cellulari nel lungo osso sono stati indagati. Questi includono l'esposizione diretta del midollo osseo femorale ¹⁶ e il trapianto ectopica di femore scissione dorsale plica WC ^17. Tuttavia, il primo è un procedimento terminale che non consente il monitoraggio delle alterazioni cellulari, strutturali e funzionali su periodi di tempo più lunghi, e il secondo probabilmente disturba la normale funzione del midollo osseo a causa del trapianto di femore, a un sito ectopica all'interno del WC dorsali plica. Un altro metodo che permette l'imaging seriale ortotopico di midollo osseo femorale nel tempo è l'uso di un WC nell'osso femorale. Un rapporto precedente ha dimostrato l'imaging a lungo termine della microcircolazione nel midollo osseo femorale utilizzando unafemore WC nei topi ^18. Inoltre, gli autori hanno dimostrato visualizzazione delle cellule tumorali nel femore, indicando la sua utilità nel monitoraggio midollo osseo metastasi. Tuttavia, questo motivo WC era limitata dalla sua grande dimensione (1,2 cm di diametro) e relativamente piccola area di esposizione (4 mm di diametro), che era adatto solo per grandi topi (26-34 g, 3-6 mesi di età) rendendo così la approccio pratico per l'uso di routine.

Pertanto, un nuovo bagno con un ingombro più piccolo e più grande area di esposizione interna creata per lo scopo di questo studio. L'obiettivo di questo studio era quello di fornire un metodo per l'imaging vari tipi di cellule nel midollo osseo femorale. Il modello di WC femore è stato sviluppato in-house ed è stato utilizzato per visualizzare e monitorare neutrofili all'interno della rete vascolare 3D. Utilizzando questo modello, IVM del midollo osseo può essere eseguito serialmente oltre 40 giorni. Questo approccio può essere applicato ad una varietà di campi per chiarire i processi di ematopoiesi, regolazione immunitaria unlo sviluppo del tumore ND.

Protocol

NOTA: Tutto il lavoro animale è stato realizzato sotto il protocollo # 2615 approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa University Health Network. 1. Preparazione chirurgica del mouse Prima dell'intervento, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e la camera di finestra (WC) in autoclave. Supplemento l'acqua potabile con 50 mg / kg di peso corporeo di amoxicillina 2 giorni prima dell'intervento. Iniettare il mouse con 0,1 mg / kg di peso corporeo di buprenorfina per …

Representative Results

Murine midollo osseo femorale si accede con successo utilizzando il WC per consentire la visualizzazione individuale neutrofili e reti vascolari. La Figura 1 mostra lo strumento WC e descrive la procedura chirurgica, che comporta l'esposizione dell'osso femorale e assottigliamento dell'osso corticale per ottenere l'accesso ottico all'interno ossea. La chirurgia è ben tollerato nei topi; sono stati valutati per reazioni fisiche avverse, come gonfiore …

Discussion

In tempo reale, imaging seriale dei processi cellulari dinamici nel midollo osseo fornisce informazioni che altrimenti difficile da ottenere con tecniche convenzionali quali l'istologia e emocromo totale. Il modello di WC femore qui descritto fornisce opportunità uniche per indagare le alterazioni cellulari e strutturali nel midollo osseo nel corso del tempo. Sebbene un modello femore WC è stato riportato in precedenza, il design innovativo fornisce un più grande campo di ripresa di vista e piccole dimensioni com…

Materials

NRCNU-F athymic nude mice	Taconic	Ncr nude	8-10 weeks old, female
Saline	Baxter	JB1302P
Ketamine hydrochloride	Bioniche Animal Health Canada, Inc.	DIN 01989529
Xylazine	Bayer HealthCare, Bayer Inc.	DIN 02169592
Surgical drape	Proxima	DYNJP2405
Electric heating pad	Life Brand	57800827375
Stereomicroscope	Leica	Leica M60
Eye ointment (tear gel)	Novartis	T296/2
7.5% betadine	Purdue Frederick Co	67618-151-16
70% isopropyl alcohol	GreenField	P010IP7P
10% betadine	Purdue Frederick Co	67618-150-05
Scalpel handle (#3)	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel blade (#15)	VWR	89176-368
Spring Scissors curved	Fine science Tools	15023-10
Baby-Mixter Hemostat	Fine science Tools	13013-14
Fine Scissors	Fine science Tools	14094-11
Extra Fine Graefe Forceps	Fine science Tools	11151-10
Halsted-Mosquito Hemostats	Fine science Tools	13008-12
Micro-drill	Harvard Apparaus	72-6065
Micro-drill burrs	Fine Science Tools	19007-14
Femur window chamber	PMCC machine shop	custom design	9.1mm- 8.5mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9mm (distance between two holes), 0.7mm (thickness)
U-shaped bar	PMCC machine shop	custom design	13.8mm (length), 1.6 mm (width), 3.7mm (height)
Coverglass (8mm)	Warner Instruments	HBIO 64-0701 CS-8R
Retaining ring (8mm)	ACKLANDS GRAINGER	UNSPSC # 31163202
Nuts (hexagon stainless steel)	Fastenal	70701
Dental cement	3M	RelyX U200
Suture (5-0 Monosof black)	Covioien	SN-5698
Halsey needle holder	Fine Science Tools	12501-13
Buprenorphine (Temgesic)	Reckitt Benckiser	DIN 0281251
Meloxicam (Metacam)	Boehringer Ingelheim	DIN 02240463
Amoxicillin (Clamavox)	Pfizer	DIN 02027879
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD2000S
APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)	eBioscience	17-9668
Two-photon microscope LSM 710	Carl Zeiss	Zeiss LSM 710 NLO
Imaging stage	PMCC machine shop	custom design	15.9cm (length), 11cm (width), 0,9cm (height)
Imaris software	Bitplane	Imaris 8.0	Image analysis software described in Section 3 of the Protocol
Zen 2012	Zeiss	Zen 2012	Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol