عظم الفخذ نافذة الغرفة نموذج ل<em> في فيفو</em> تتبع الخلايا في الفئران نخاع العظام
Summary
The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.
Abstract
Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.
Introduction
نخاع العظام هو الجهاز الهام تشارك في تكون الدم وتنظيم جهاز المناعة. وهو يتألف من عنصر المكونة للدم التي تحتوي على الجذعية والسلف الخلايا المكونة للدم (HSPCs)، وعنصر اللحمية التي تحتوي على الخلايا الاولية غير المكونة للدم التي تؤدي إلى خلايا اللحمة المتوسطة 1. ثلثي النشاط للدم مكرس لتوليد خلايا الدم النخاعي 2. على وجه الخصوص، ويتم إنتاج عدد كبير من العدلات في نخاع العظم، مع 1-2 × 10 11 الخلايا المتولدة يوميا في الكبار الإنسان العادي 2. العدلات هي خط الدفاع الأول ضد العدوى الميكروبية ومحفوظة في معظمها في نخاع العظم حتى يؤدي الإجهاد تعبئة لتكملة العدلات المحيطية 1،3. بالإضافة إلى آثارها المضادة للميكروبات، وتشير الدراسات الحديثة دورا هاما العدلات في بيولوجيا السرطان، وكان كل من المؤيدين والظواهر المعادية للمكون للأورام اعتمادا على تحويل النموعامل بيتا (TGF-β) يشير في 4،5 الورم المكروية. وعلاوة على ذلك، فإن الدراسات تبين أن العدلات التي تتراكم في الأورام الأولية تمارس الآثار المؤيدة للمكون للأورام والمتنقل من خلال قمع وظيفة السامة للخلايا من خلايا تي 6،7، في حين العدلات في الدورة الدموية تبسط السامة للخلايا، تأثير مضاد للالمنتشر 8. على هذا النحو، والتحقيق في الخلايا المكونة للدم في نخاع العظم، ولا سيما العدلات، أمر حاسم لتوضيح دورها في تنظيم المناعة، والورم.
تستخدم التشريح واستكمال الطرفية تعداد الدم بشكل روتيني لتقييم التغيرات الخلوية والهيكلية في نخاع العظم 9. ومع ذلك، توفر هذه الأساليب فقط معلومات ثابتة من السكان مختلفة من الخلايا أو الأنسجة المجهرية. طولية في مجال التصوير فيفو يمكن استخدامها في تركيبة مع طرق معيارية لتقييم ديناميات المكونات الخلوية، والأوعية الدموية وانسجة متعددة وكذلك الخلية الى جالتفاعلات الذراع بطريقة طولية. intravital المجهري (IVM)، الذي يعرف بأنه التصوير من الحيوانات التي تعيش في قرار المجهري 10، مفيد بشكل خاص لتقييم العمليات الخلوية الحيوية على مر الزمن في نفس العينة، مما يقلل من عدد من حيوانات التجارب المطلوبة. IVM غالبا ما يتم دمجها مع غرفة نافذة زرع مزمنة (مرحاض) للوصول إلى الجهاز من الفائدة للتصوير خلال مدة أسابيع أو شهور. نماذج مرحاض في الجمجمة وظهري طبقات الجلد لها أطول تاريخ من استخدام يعود تاريخها إلى منتصف 1990s. وفي الآونة الأخيرة، وقد وضعت نماذج أخرى-جهاز معين مرحاض مثل تلك لوحة الدهون الثديية ومختلف أعضاء البطن (11).
النهج التقليدي لتصوير النخاع العظمي في الجسم الحي قد تعرض أساسا تشارك في calvaria من الفئران، حيث تمكن العظام ضعيفة رؤية مباشرة من الخلايا وحيدة مع الحد الأدنى من التدخل الجراحي 12-14. ومع ذلك، فإن نخاع العظام قبة القحف قد بالبريد متميز من أن العظام الأخرى، مثل العظام الطويلة، كما يتبين من عدد أقل من HSPCs وخلايا ميتة في calvaria مما يؤدي الى خفض صيانة وتطوير HSPCs 15. لذلك، تم التحقيق فيها النهج البديلة لتقييم المكونات الخلوية في العظام الطويلة. وتشمل هذه التعرض المباشر للنخاع العظم الفخذي 16 وزرع خارج الرحم من عظم الفخذ تقسيم في طبقات الجلد الظهري WC 17. ومع ذلك، فإن الأول هو إجراء المحطة لا تسمح بتتبع التغيرات الخلوية والهيكلية والوظيفية على مدى فترات زمنية أطول، وعلى الأرجح الأخير يزعج وظيفة عادية نخاع العظام نتيجة لزرع عظم الفخذ إلى موقع خارج الرحم داخل مرحاض ظهري طبقات الجلد. طريقة أخرى تمكن التصوير المسلسل مثلي من نخاع عظم الفخذ مع مرور الوقت هو استخدام مرحاض في العظام الفخذ. أظهر تقرير واحد السابقة التصوير على المدى الطويل من دوران الأوعية الدقيقة في نخاع العظم الفخذ باستخدامالفخذ مرحاض في الفئران (18). بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الكتاب التصور من الخلايا السرطانية في عظم الفخذ، مما يدل على فائدتها في رصد نخاع العظام ورم خبيث. ومع ذلك، كان هذا التصميم مرحاض محدودة بسبب حجمها الكبير (1.2 سم القطر) ومنطقة التصوير صغيرة نسبيا (4 مم)، والتي كانت مناسبة فقط للفئران كبيرة (26-34 ز 3-6 أشهر من العمر) مما يجعل نهج عملي للاستخدام الروتيني.
لذلك، تم تصميم مرحاض جديد مع الحجم الكلي أصغر وأكبر منطقة التصوير الداخلي لغرض هذه الدراسة. وكان الهدف من هذه الدراسة لتوفير طريقة لتصوير مختلف أنواع الخلايا في نخاع العظم الفخذي. تم تطوير نموذج WC عظم الفخذ في المنزل، وكان يستخدم لتصور وتتبع العدلات ضمن شبكة الأوعية الدموية 3D. استخدام هذا النموذج، IVM من نخاع العظام لا يمكن أن يؤديها بشكل متسلسل أكثر من 40 يوما. ويمكن تطبيق هذا النهج في مجموعة متنوعة من المجالات لتوضيح عمليات تكون الدم، وتنظيم المناعةالثانية نمو الورم.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الوقت الحقيقي، والتصوير التسلسلي للعمليات الخلوية الحيوية في نخاع العظام ويوفر المعلومات التي يتم تحدي خلاف ذلك للحصول على استخدام التقنيات التقليدية مثل الأنسجة وإجمالي تعداد الدم. نموذج WC عظم الفخذ هو موضح هنا يوفر فرصا فريدة لتحقيق التعديلات الخلوية والهيكل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر مرفق المتقدم بصري المجهر (www.aomf.ca) في الشبكة الصحية الجامعية للمساعدة مع المجهر، والسيد جيسون ايليس من الأميرة مارغريت مركز سرطان محل آلة لتصنيع مرحاض ومرحلة التصوير. كما نود أن نشكر الدكتور ايريس Kulbatski لتحرير مخطوطة.
Materials
| NRCNU-F athymic nude mice | Taconic | Ncr nude | 8-10 weeks old, female |
| Saline | Baxter | JB1302P | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Surgical drape | Proxima | DYNJP2405 | |
| Electric heating pad | Life Brand | 57800827375 | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M60 | |
| Eye ointment (tear gel) | Novartis | T296/2 | |
| 7.5% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-151-16 | |
| 70% isopropyl alcohol | GreenField | P010IP7P | |
| 10% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-150-05 | |
| Scalpel handle (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blade (#15) | VWR | 89176-368 | |
| Spring Scissors curved | Fine science Tools | 15023-10 | |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine science Tools | 13013-14 | |
| Fine Scissors | Fine science Tools | 14094-11 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine science Tools | 11151-10 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | Fine science Tools | 13008-12 | |
| Micro-drill | Harvard Apparaus | 72-6065 | |
| Micro-drill burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | |
| Femur window chamber | PMCC machine shop | custom design | 9.1mm- 8.5mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9mm (distance between two holes), 0.7mm (thickness) |
| U-shaped bar | PMCC machine shop | custom design | 13.8mm (length), 1.6 mm (width), 3.7mm (height) |
| Coverglass (8mm) | Warner Instruments | HBIO 64-0701 CS-8R | |
| Retaining ring (8mm) | ACKLANDS GRAINGER | UNSPSC # 31163202 | |
| Nuts (hexagon stainless steel) | Fastenal | 70701 | |
| Dental cement | 3M | RelyX U200 | |
| Suture (5-0 Monosof black) | Covioien | SN-5698 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12501-13 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Reckitt Benckiser | DIN 0281251 | |
| Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim | DIN 02240463 | |
| Amoxicillin (Clamavox) | Pfizer | DIN 02027879 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD2000S | |
| APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) | eBioscience | 17-9668 | |
| Two-photon microscope LSM 710 | Carl Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | |
| Imaging stage | PMCC machine shop | custom design | 15.9cm (length), 11cm (width), 0,9cm (height) |
| Imaris software | Bitplane | Imaris 8.0 | Image analysis software described in Section 3 of the Protocol |
| Zen 2012 | Zeiss | Zen 2012 | Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol |
References
- Zhao, E., et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. Tumor-associated neutrophils: friend or foe?. Carcinogenesis. , (2012).
- Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: ‘N1’ versus ‘N2 TAN. Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).
- Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).
- Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging. IntraVital. 3 (2), e29917 (2014).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. (96), e52476 (2015).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1. J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow. J. Vis. Exp. (91), e51683 (2014).
- Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).
- Balan, M., Kiefer, F. A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs. IntraVital. 4 (2), e1066949 (2015).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Femur window–a new approach to microcirculation of living bone in situ. J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).
- Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296 (2011).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Bucher, K., et al. Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice. J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), (2013).
- Koewler, N. J., et al. Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur. J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M., Singh, S. R., Coppola, V. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. 1194, 289-312 (2014).
