Бедро Window камера Модель<em> В Vivo</em> Отслеживание Cell в мышиных костного мозга

Summary

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Abstract

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Introduction

Костный мозг является важным органом участвует в кроветворении и регуляции иммунной системы. Он состоит из компонента , содержащего кроветворной гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) и стромальных компонент , содержащий не-кроветворных клеток – предшественников , которые приводят к мезенхимальных клеток ^1. Две трети кроветворной деятельности посвящена поколению миелоидных клеток ^2. В частности, большое количество нейтрофилов в костном мозге, при 1-2 х 10 ¹¹ клеток , полученных в день в нормального взрослого человека ^2. Нейтрофилы являются первой линией защиты от микробной инфекции и в основном сохраняются в костном мозге , пока стресс не вызывает их мобилизацию в дополнение нейтрофилов периферической ^1,3. В дополнение к их антимикробных эффектов, недавние исследования указывают на важную роль нейтрофилов в биологии рака, имеющие как про- и анти-онкогенными фенотипы в зависимости от роста преобразующейКоэффициент бета (TGF-β) сигнализации в опухоль микроокружения ^4,5. Кроме того, исследования показали , что нейтрофилы , которые накапливаются в первичных опухолях оказывают про-онкогенных и метастатических эффекты путем подавления цитотоксическую функцию Т – клеток ^6,7, в то время как нейтрофилы в обращении оказывают цитотоксическое, антиметастатическую эффект ^8. Таким образом, исследование гемопоэтических клеток в костном мозге, в частности нейтрофилах, имеет решающее значение для их выяснении роль в иммунной и опухолевой регуляции.

Гистологическое и полный периферийный анализ крови , которые обычно используются для оценки клеточных и структурные изменения в костном мозге ^9. Тем не менее, эти методы обеспечивают только статическую информацию о различных клеточных популяций или микроструктур тканей. Продольный в естественных изображений могут быть использованы в сочетании со стандартными методами с целью оценки динамики нескольких клеточных, сосудистых и стромальных компонентов, а также от клетки к CELL взаимодействия в продольном образом. Прижизненные микроскопии (IVM), определяется как визуализации живых животных при микроскопическом разрешением ^10, является особенно полезным для оценки динамических клеточных процессов , в течение долгого времени в том же самом образце, уменьшая количество экспериментальных животных требуется. IVM часто сочетается с хронически пересаженной окна камеры (WC), чтобы получить доступ к органу интереса для визуализации в течение периода от нескольких недель до месяцев. Черепных и спинных-складка WC модели имеют самую длинную историю использования, начиная с середины 1990-х годов. Совсем недавно другие органоспецифические WC модели , такие как таковые из жировой ткани молочных желез и различных органах брюшной полости, были разработаны ^11.

Типичный подход для визуализации костного мозга в естественных условиях имеет в основном вовлечены воздействие на своде черепа мышей, где утонченная кости позволяет осуществлять прямую визуализацию отдельных клеток с минимальным хирургическим вмешательством ^12-14. Тем не менее, свода черепа костный мозг может бе отличие от других костей, таких как длинной кости, как продемонстрировано меньшим количеством HSPCs и гипоксических клеток в своде черепа, что свидетельствует сокращает расходы на содержание и развитие HSPCs ^15. Таким образом, альтернативные подходы для оценки клеточных компонентов в длинной кости были исследованы. К ним относятся прямое облучение костного мозга бедренной кости ¹⁶ и внематочной трансплантация разделенной бедренной кости в дорсальной кожной складки WC ^17. Тем не менее, первый является терминал процедура, которая не позволяет отслеживать клеточных, структурных и функциональных изменений в течение более длительных периодов времени, и последний, вероятно, нарушает нормальную функцию костного мозга из-за трансплантацией бедренной кости к внематочной месте внутри спинной кожной складки WC. Другой метод, который позволяет ортотопической последовательного визуализации костного мозга бедренной кости в течение долгого времени является использование туалета в бедренной кости. Один предыдущий доклад продемонстрировал долгосрочный визуализации микроциркуляции в костном мозге бедра с использованиембедренной кости туалет у мышей ^18. Кроме того, авторы продемонстрировали визуализацию опухолевых клеток в бедренной кости, что указывает на его полезность в деле мониторинга костного метастаза мозга. Тем не менее, эта конструкция WC был ограничен его большой размер (диаметр 1,2 см) и относительно небольшой площади изображения (4 мм в диаметре), который подходит только для больших мышей (26-34 г, в 3-6-месячном возрасте), тем самым делая подход непрактичным для повседневного использования.

Таким образом, новый туалет с меньшим общим размером и большей площади внутренней обработки изображений был разработан для целей настоящего исследования. Цель данного исследования состояла в том, чтобы обеспечить способ для визуализации различных типов клеток в костном мозге бедра. Модель WC бедренной кости была разработана в доме и был использован для визуализации и отслеживания нейтрофилов в 3D сосудистой сети. С помощью этой модели ИВМ костного мозга может быть выполнена последовательно в течение 40 дней. Этот подход может быть применен к различным полей для выяснения процессов кроветворения, иммунной регуляцииразвитие опухоли й.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все для животных работа была проведена по протоколу # 2615, утвержденным Institutional уходу и использованию животных комитета университета сеть здравоохранения путем. 1. Хирургическая подготовка мыши До операции стерилизации все хирургические инструменты и окно камеры …

Representative Results

Murine femoral bone marrow is successfully accessed using the WC to enable visualization of individual neutrophils and vascular networks. Figure 1 shows the WC instrument and describes the surgical procedure, which involves exposure of the femoral bone and thinning of cortical bone to gain optical access inside the bone. The surgery is well-tolerated in mice; they were assessed for adverse physical reactions, such as hind limb swelling, non-weight bearing on limb, self-mu…

Discussion

Real-time, serial imaging of the dynamic cellular processes in bone marrow provides information that is otherwise challenging to obtain using conventional techniques such as histology and total blood counts. The femur WC model described here provides unique opportunities to investigate cellular and structural alterations in the bone marrow over time. Although a femur WC model has been previously reported, our novel design provides a larger imaging field of view and smaller overall WC size, which are more compatible for u…

Materials

NRCNU-F athymic nude mice	Taconic	Ncr nude	8-10 weeks old, female
Saline	Baxter	JB1302P
Ketamine hydrochloride	Bioniche Animal Health Canada, Inc.	DIN 01989529
Xylazine	Bayer HealthCare, Bayer Inc.	DIN 02169592
Surgical drape	Proxima	DYNJP2405
Electric heating pad	Life Brand	57800827375
Stereomicroscope	Leica	Leica M60
Eye ointment (tear gel)	Novartis	T296/2
7.5% betadine	Purdue Frederick Co	67618-151-16
70% isopropyl alcohol	GreenField	P010IP7P
10% betadine	Purdue Frederick Co	67618-150-05
Scalpel handle (#3)	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel blade (#15)	VWR	89176-368
Spring Scissors curved	Fine science Tools	15023-10
Baby-Mixter Hemostat	Fine science Tools	13013-14
Fine Scissors	Fine science Tools	14094-11
Extra Fine Graefe Forceps	Fine science Tools	11151-10
Halsted-Mosquito Hemostats	Fine science Tools	13008-12
Micro-drill	Harvard Apparaus	72-6065
Micro-drill burrs	Fine Science Tools	19007-14
Femur window chamber	PMCC machine shop	custom design	9.1mm- 8.5mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9mm (distance between two holes), 0.7mm (thickness)
U-shaped bar	PMCC machine shop	custom design	13.8mm (length), 1.6 mm (width), 3.7mm (height)
Coverglass (8mm)	Warner Instruments	HBIO 64-0701 CS-8R
Retaining ring (8mm)	ACKLANDS GRAINGER	UNSPSC # 31163202
Nuts (hexagon stainless steel)	Fastenal	70701
Dental cement	3M	RelyX U200
Suture (5-0 Monosof black)	Covioien	SN-5698
Halsey needle holder	Fine Science Tools	12501-13
Buprenorphine (Temgesic)	Reckitt Benckiser	DIN 0281251
Meloxicam (Metacam)	Boehringer Ingelheim	DIN 02240463
Amoxicillin (Clamavox)	Pfizer	DIN 02027879
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD2000S
APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)	eBioscience	17-9668
Two-photon microscope LSM 710	Carl Zeiss	Zeiss LSM 710 NLO
Imaging stage	PMCC machine shop	custom design	15.9cm (length), 11cm (width), 0,9cm (height)
Imaris software	Bitplane	Imaris 8.0	Image analysis software described in Section 3 of the Protocol
Zen 2012	Zeiss	Zen 2012	Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol