Lårben Fönster Chamber modell för<em> In Vivo</em> Cell Spårning i murina benmärgs

Summary

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Abstract

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Introduction

Benmärg är ett viktigt organ som deltar i hematopoes och immunreglering. Den består av en hematopoetisk komponent innehållande hematopoietiska stam- och stamfaderceller (HSPCs), och en stromal komponent innehållande icke-hematopoetiska progenitorceller som ger upphov till mesenkymala celler ^1. Två tredjedelar av hematopoetisk aktivitet är tillägnad generering av myeloidceller ^2. I synnerhet, är ett stort antal neutrofiler som produceras i benmärgen, med 1-2 x 10 ¹¹ celler alstras per dag i en normal vuxen människa ^2. Neutrofiler är de första försvarslinjen mot mikrobiella infektioner och är oftast reserverade i benmärgen tills stress utlöser deras mobilisering att komplettera perifera neutrofiler ^1,3. Förutom sina antimikrobiella effekter, nya studier tyder på en viktig roll neutrofiler i cancerbiologi, som har både pro- och anti-tumörogena fenotyper beroende på transformerande tillväxtfaktorbeta (TGF-β) signalering i tumören mikromiljö ^4,5. Dessutom studier har visat att neutrofiler som ackumuleras i primära tumörer utövar pro-tumörogena och metastaserande effekter genom att undertrycka cytotoxiska funktionen av T-celler ^6,7, medan neutrofiler i omlopp utöva en cytotoxisk, anti-metastaserande effekt ^8. Som sådan, är avgörande för att belysa deras roll i immun- och tumörreglering undersökning av hematopoietiska celler i benmärgen, i synnerhet neutrofiler,.

Histopatologi och en fullständig perifer blodstatus rutinmässigt används för att utvärdera cellulära och strukturella förändringar i benmärgen ^9. Men bara dessa metoder ger statisk information av olika cellpopulationer eller vävnadsmikro. Längsgående in vivo imaging kan användas i kombination med standardmetoder för att bedöma dynamiken i flera cellulära, vaskulära och stromala komponenter samt cell-till-cELL interaktioner i ett längsgående sätt. Intravital mikroskopi (IVM), definierad som avbildning av levande djur vid mikroskopisk upplösning ^10, är speciellt användbar för att bedöma dynamiska cellulära processer över tiden i samma prov, minska antalet försöksdjur krävs. IVM kombineras ofta med ett kroniskt trans fönster kammare (WC) för att komma åt organ av intresse för avbildning över en period av veckor till månader. Kraniala och rygg-skinfold WC modeller har den längsta historien av användning går tillbaka till mitten av 1990-talet. På senare tid har andra organspecifika WC modeller såsom de av bröstfettkudden och olika bukorganen utvecklats ^11.

Den typiska tillvägagångssätt för avbildning benmärg in vivo har huvudsakligen arbetar exponering av calvaria av möss, där den förtunnade benet möjliggör direkt visualisering av enskilda celler med minimal kirurgiska ingrepp ^12-14. Emellertid kan calvarial benmärg be skiljer sig från andra ben, såsom långa ben, vilket framgår av ett lägre antal HSPCs och hypoxiska celler i calvaria, vilket indikerar minskat underhåll och utveckling av HSPCs ^15. Därför har alternativa metoder för att bedöma cellkomponenter i det långa benet undersökts. Dessa innefattar direkt exponering av lårbens benmärg ¹⁶ och ektopisk transplantation av split lårben i rygg skinfold WC ^17. Emellertid är den tidigare en terminal förfarande som inte tillåter spårning av cellulära, strukturella och funktionella förändringar över längre tidsperioder, och senare troligen stör normal benmärgsfunktion på grund av transplantation av lårbenet till en ektopisk plats inuti rygg skinfold WC. En annan metod som gör det möjligt för orthotopic seriell avbildning av femoral benmärg över tiden är användningen av en WC i den femorala benet. En tidigare rapport visade långsiktiga avbildning av mikrocirkulationen i lårbens benmärgen med hjälp av enlårben WC i möss ^18. Dessutom författarna visat visualisering av tumörceller i lårbenet, vilket indikerar dess användbarhet vid övervakning benmärgs metastas. Emellertid var detta WC konstruktion begränsas av sin storlek (1,2 cm diameter) och relativt liten bildyta (4 mm diameter), som var endast lämplig för stora möss (26-34 g, 3-6 månaders ålder) varigenom närma sig opraktiskt för rutinmässig användning.

Därför har en ny toalett med en mindre total storlek och större inner avbildning område som är avsett för ändamålet med denna studie. Målet med denna studie var att tillhandahålla ett förfarande för avbildning av olika celltyper i den femorala benmärgen. Lårbenet WC-modellen har utvecklats internt och användes för att visualisera och spåra neutrofiler inom 3D vaskulära nätverket. Med hjälp av denna modell, kan IVM i benmärgen göras seriellt över 40 dagar. Detta tillvägagångssätt kan tillämpas på en mängd olika områden för att klargöra processerna för hematopoies, immunreglering ennd tumörutveckling.

Protocol

OBS: Alla djur Arbetet utfördes enligt protokoll # 2615 godkändes av University Health Network Institutional Animal Care och användning kommittén. 1. Kirurgisk Beredning av Mouse Före operation, sterilisera alla kirurgiska instrument och fönsterkammaren (WC) genom autoklavering. Komplettera dricksvattnet med 50 mg / kg kroppsvikt av amoxicillin 2 dagar före operation. Injicera musen med 0,1 mg / kg kroppsvikt av buprenorfin intraperitonealt 4 h före operation. Söva atymiska nakna mu…

Representative Results

Murin lårbens benmärg framgångsrikt nås med hjälp av WC för att möjliggöra visualisering av enskilda neutrofiler och vaskulära nätverk. Figur 1 visar WC instrument och beskriver det kirurgiska ingreppet, som innebär exponering av lårbens ben och förtunning av kortikalt ben för att få optisk access inuti ben. Operationen är väl tolererad i möss; de bedömdes för negativa fysiska reaktioner, såsom bakbens svullnad, icke-viktbärande på lem, självstymp…

Discussion

Realtid, seriell avbildning av de dynamiska cellulära processer i benmärg ger information som annars är utmanande att erhålla med användning av konventionella tekniker, såsom histologi och totala blodstatus. Lårbenet WC modell som beskrivs här ger unika möjligheter att undersöka cellulära och strukturella förändringar i benmärgen över tiden. Även ett lårben WC modell har tidigare rapporterats, ger vår nya design en större avbildning synfält och mindre total toalett storlek, som är mer kompatibel fö…

Materials

NRCNU-F athymic nude mice	Taconic	Ncr nude	8-10 weeks old, female
Saline	Baxter	JB1302P
Ketamine hydrochloride	Bioniche Animal Health Canada, Inc.	DIN 01989529
Xylazine	Bayer HealthCare, Bayer Inc.	DIN 02169592
Surgical drape	Proxima	DYNJP2405
Electric heating pad	Life Brand	57800827375
Stereomicroscope	Leica	Leica M60
Eye ointment (tear gel)	Novartis	T296/2
7.5% betadine	Purdue Frederick Co	67618-151-16
70% isopropyl alcohol	GreenField	P010IP7P
10% betadine	Purdue Frederick Co	67618-150-05
Scalpel handle (#3)	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel blade (#15)	VWR	89176-368
Spring Scissors curved	Fine science Tools	15023-10
Baby-Mixter Hemostat	Fine science Tools	13013-14
Fine Scissors	Fine science Tools	14094-11
Extra Fine Graefe Forceps	Fine science Tools	11151-10
Halsted-Mosquito Hemostats	Fine science Tools	13008-12
Micro-drill	Harvard Apparaus	72-6065
Micro-drill burrs	Fine Science Tools	19007-14
Femur window chamber	PMCC machine shop	custom design	9.1mm- 8.5mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9mm (distance between two holes), 0.7mm (thickness)
U-shaped bar	PMCC machine shop	custom design	13.8mm (length), 1.6 mm (width), 3.7mm (height)
Coverglass (8mm)	Warner Instruments	HBIO 64-0701 CS-8R
Retaining ring (8mm)	ACKLANDS GRAINGER	UNSPSC # 31163202
Nuts (hexagon stainless steel)	Fastenal	70701
Dental cement	3M	RelyX U200
Suture (5-0 Monosof black)	Covioien	SN-5698
Halsey needle holder	Fine Science Tools	12501-13
Buprenorphine (Temgesic)	Reckitt Benckiser	DIN 0281251
Meloxicam (Metacam)	Boehringer Ingelheim	DIN 02240463
Amoxicillin (Clamavox)	Pfizer	DIN 02027879
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD2000S
APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)	eBioscience	17-9668
Two-photon microscope LSM 710	Carl Zeiss	Zeiss LSM 710 NLO
Imaging stage	PMCC machine shop	custom design	15.9cm (length), 11cm (width), 0,9cm (height)
Imaris software	Bitplane	Imaris 8.0	Image analysis software described in Section 3 of the Protocol
Zen 2012	Zeiss	Zen 2012	Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol