シングルコホートコロニーと労働者ミツバチのホルモン治療の準備は役割および/または内分泌系との生理学関連を分析します
Summary
役割に関連する労働者の生理機能を解析するための便利なツール – ここでは、単一コホートミツバチコロニーの製造のための私達の詳細なプロトコルを記述します。また、労働者の行動および/または生理の調節におけるこれらのホルモンの関与を評価するために、幼若ホルモンおよびエクジソンで労働者を治療するための詳細なプロトコルを記述します。
Abstract
Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.
Introduction
ヨーロッパミツバチ、 ミツバチは 、高度に組織化された社会1と真社会性昆虫です。ワーカーミツバチ（労働カーストは）労働2-4の年齢関連部門と呼ばれる、コロニー活性を維持するためにさまざまなタスクに従事し、かつ、これらのタスクは、羽化後ワーカーミツバチの年齢に応じて変更されています。若年労働者（<13日齢）高齢労働者がいる間、ローヤルゼリー（看護師蜂）を分泌することによりハイブのひなの世話をする（> 15日齢）はハイブ（飼料収穫機）2-4の外に蜜や花粉を集めます。労働者の生理機能は、この役割のシフトに関連して変化します。例えば、下咽頭腺（HPGs）の機能は、頭部に位置する外分泌腺、2,5を採餌する看護か らロールシフトに関連して変化をペアリング。ナース蜂HPGsは、主に蜂のミルクの主要な構成要素である主要なローヤルゼリーのタンパク質を合成します。一方、飼料収穫機HPGs主ブドウ糖と果糖にショ糖を変換することによって蜂蜜に蜜を処理するために、このようなαグルコシダーゼIIIなどの炭水化物代謝酵素を合成。我々の以前の研究では、α-グルコシダーゼIIIをコードする主要なローヤルゼリータンパク質、およびHBG3、ロールシフト6-9中の変更をエンコードするmrjp2の発現、ことを明らかにしました。
HPGsを含む労働者の組織における生理的変化は、ロールシフトまたは労働者の年齢と関連しているかどうかを判断するためには、単一のコホートを準備するなど、ミツバチのコロニーの人口構成を操作することが有用ですほぼ同じ年齢の労働者が異なるタスク10,11を実行したコロニー。ロビンソンら （1989）は、単一のコホートコロニー10を確立するための方法を記載しています。シングルコホートコロニーは、最初は女王と0-2日齢の労働者を含みます。コロニーを確立した後、数日間、ALMの労働者同じ年齢OST異なるタスクを想定しています。他の労働者がいつもより早く採餌タスクを実行するため、早熟飼料収穫機と呼ばれているのに対し、一部の労働者は、典型的なコロニーのように看護タスクを実行します。看護師の蜂と早熟飼料収穫機間の遺伝子発現の比較は、労働者の組織12-16の役割に関連した生理機能に関する有用な情報を提供するであろう。ここでは、ロールベースおよび/ またはHPGs 16の加齢に伴う生理機能の解析のための単一のコホートのコロニーを調製するための詳細なプロトコルを記述します。我々はまた、簡単にHPGの生理機能を評価するために、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によってmrjp2とHBG3の遺伝子発現を検査する方法について説明します。
シングルコホートコロニー内のワーカー生理学の分析に加えて、内分泌系の検査は、役割に関連する労働者の生理機能の調節機構を解析するために重要です。自演れる幼若ホルモン（JH）、昆虫の幼虫の「現状」ホルモンとしてWN、ワーカーミツバチ11で採餌への看護の役割のシフトを加速します。また、変態の間に脱皮ホルモンとして知られているエクジソンは、、キノコ体に労働者の脳17-19の高い中心部を表現しているジソンシグナル伝達分子をコードする遺伝子としての役割シフトに関与している可能性があります。したがって、我々はまた、HPG生理学上の内分泌系の効果の分析（の発現のために詳細なエクジソンの活性型である20Eと労働者を治療するために、我々の以前の研究16で使用されるプロトコル、およびメトプレン、JHアナログを、記述しますmrjp2とHBG3）。
Protocol
Representative Results
Discussion
シングルコホートコロニーの調製
ここでは、働きバチの役割の変化に関連したHPG生理学の分析のための単一のコホートのコロニーを準備するために私たちの以前の研究16で使用されるプロトコルを説明しました。手順1.6から1.7と図2に記載された基準を満たした看護師蜂と早熟飼料収穫機は、シングルコホートコロニー（ 表1）で観察され?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and a Grant-in Aid for Scientific Research on Innovative Areas ‘Systems Molecular Ethology’ from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan. T.U. was the recipient of a Grant-Aid from the Japan Society for the Promotion of Science for Young Scientists.
Materials
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
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