Preparação de Colônias-coorte único e tratamento hormonal do trabalhador de abelhas para analisar Fisiologia Associated com a função e / ou sistema endócrino
Summary
Aqui nós descrevemos nosso protocolo detalhado para a preparação de colônias de abelhas-coorte único – uma ferramenta útil para analisar a fisiologia trabalhador associada à função. Descrevemos também protocolos detalhados para o tratamento de trabalhadores com hormônio juvenil e ecdisona para avaliar o envolvimento desses hormônios na regulação do comportamento do trabalhador e / ou fisiologia.
Abstract
Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.
Introduction
A abelha europeia, Apis mellifera, é um inseto eusocial com uma sociedade altamente organizada 1. Abelhas operárias (casta de trabalho) estão envolvidos em várias tarefas para manter a atividade colônia, e estas tarefas mudar de acordo com a idade da abelha trabalhador após a eclosão, o que é referido como a divisão relacionada com a idade do trabalho 2-4. Os trabalhadores jovens (<13 dias de idade) cuidar da ninhada na colmeia através da secreção de geléia real (abelhas enfermeira), enquanto os trabalhadores mais velhos (> 15 dias de idade) recolhem o néctar e pólen fora da colméia (forrageiras) 2-4. A fisiologia dos trabalhadores muda em associação com esta mudança de papel. Por exemplo, a função das glândulas hipofaringe (HPGS), emparelhado glândulas exócrinas localizadas na cabeça, alterações em associação com a mudança de papel a partir de enfermagem para forrageamento 2,5. HPGS enfermeira abelha sintetizar principalmente principais proteínas da geléia real, que são os principais componentes do leite de abelha. Por outro lado, HPGS de forrageiras, principalmente,sintetizar enzimas metabolizadoras de hidratos de carbono, tais como α-glucosidase III, para processar néctar em mel através da conversão de sacarose em glicose e frutose. Os nossos estudos anteriores revelaram que a expressão de mrjp2, que codifica uma proteína principal da geleia real, e Hbg3, que codifica α-glucosidase III, alterações durante o deslocamento papel 6-9.
Para determinar se as alterações fisiológicas dos tecidos de trabalho, incluindo as HPGS, está associada com a mudança de papel ou com a idade dos trabalhadores, seria útil para manipular a composição da população de uma colónia de abelhas, tal como para preparar uma única coorte colónias em que os trabalhadores de quase a mesma idade executar diferentes tarefas 10,11. Robinson et al. (1989) descreveram um método para o estabelecimento de uma colónia única de 10-coorte. colónias-coorte único compreendem inicialmente uma rainha e 0-2 dia os trabalhadores de idade. Vários dias depois de estabelecer as colônias, os trabalhadores de almost a mesma idade assumir diferentes tarefas. Alguns trabalhadores executar tarefas de enfermagem como em colónias típicas, enquanto outros trabalhadores executar tarefas de forrageamento mais cedo do que o habitual e são assim chamados forrageiras precoces. Comparações de expressão genética entre as abelhas de enfermagem e forrageiras precoces iria fornecer informações úteis sobre a fisiologia associada ao papel dos tecidos trabalhador 12-16. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de colónias-coorte único para análise da fisiologia de papéis e / ou associada à idade de HPGS 16. Também descrevemos brevemente como analisar a expressão gênica de mrjp2 e Hbg3 por quantitativa reação em cadeia de polimerase reversa (RT-PCR) para avaliar HPG fisiologia.
Para além da análise de fisiologia trabalhador em colónias-coorte único, o exame do sistema endócrino é importante para analisar os mecanismos de regulação da fisiologia associada trabalhador-papel. hormônio juvenil (JH), que é known como o hormônio 'status quo' em larvas de insetos, acelera a mudança no papel da enfermagem para forrageamento de abelhas operárias 11. Além disso, de ecdisona, que é conhecida como a hormona de muda durante a metamorfose, podem estar envolvidos na mudança de papel como genes que codificam para moléculas de sinalização de ecdisona são expressas nos corpos de cogumelo, um centro superior do cérebro trabalhador 17-19. Por isso, também descrevem o protocolo detalhado utilizado no nosso estudo anterior 16 para tratar os trabalhadores com 20E, que é uma forma activa de ecdisona, e metopreno, um análogo de JH, para análise do efeito do sistema endócrino em HPG fisiologia (expressão de mrjp2 e Hbg3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Preparação de colónias-coorte única
Aqui descrevemos o protocolo utilizado em nosso estudo anterior 16 para preparar colónias-coorte único para análise da HPG fisiologia associada com a mudança no papel das abelhas operárias. Abelhas de enfermagem e forrageiras precoces que satisfizeram os critérios descritos nos procedimentos de 1,6-1,7 e Figura 2 foram observadas nas colônias-coorte único (Tabela 1). As fotografias da Figura …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and a Grant-in Aid for Scientific Research on Innovative Areas ‘Systems Molecular Ethology’ from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan. T.U. was the recipient of a Grant-Aid from the Japan Society for the Promotion of Science for Young Scientists.
Materials
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
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