Автоматизированная двухслойной липидной мембраной, Образование Использование тонкой пленки полидиметилсилоксана
Summary
Мы демонстрируют Storable, транспортабельные липидную систему образования двухслойная. Липидный бислой мембрана может быть сформирована в течение 1 часа с вероятностью успеха более 80%, когда предшественник замороженный мембрана доводят до температуры окружающей среды. Эта система позволит сократить трудоемкие процессы и опыт, связанные с ионными каналами.
Abstract
Искусственный липидный бислой, или черный липидной мембраны (БЛМ), является мощным инструментом для изучения ионных каналов и белковых взаимодействий, а также для биосенсоров приложений. Однако традиционные методы BLM формирования имеют ряд недостатков, и они часто требуют специальных знаний и трудоемкие процессы. В частности, обычные БЛМ страдают от низких показателей успешности формирования и непоследовательным времени формирования мембраны. Здесь мы демонстрируем сохраняемыми и переносимыми систему BLM пласта с регулируемой прореживания-аут времени и повышения скорости образования BLM путем замены традиционно используемых пленок (политетрафторэтилен, полиоксиметилен, полистирол) для полидиметилсилоксана (PDMS). В этом эксперименте используют пористый структурированный полимер, такой как PDMS тонкой пленки. Кроме того, в отличие от традиционно используемых растворителей с низкой вязкостью, использование сквалена допускается контролируемое разжижающие Расчетный час с помощью медленного поглощения растворителя с помощью ПДМС, увеличить срок службы мембраны. В рекламеусловие, при использовании смеси сквален и гексадекану, точка замерзания раствора липида была увеличена (~ 16 ° C), кроме того, мембранные предшественники были произведены, которые могут быть неограниченно храниться и легко транспортируемой. Эти мембранные предшественники сократили BLM время формирования <1 ч и достиг BLM скорости формирования ~ 80%. Кроме того, эксперименты ионных каналов с грамицидина А продемонстрирована возможность мембранной системы.
Introduction
Искусственный липидный бислой мембраны, или черный липидная мембрана (BLM), является важным инструментом для выяснения механизмов клеточных мембран и ионных каналов, а также для понимания процессов взаимодействия ионных каналов и ионов / молекул. 1-7 Хотя метод пэтч-кламп часто считается золотым стандартом для клеточных мембран исследований, является трудоемким и требует высокой квалификации операторов для измерения ионных каналов. 8 в то время как искусственно воссозданных липидный бислой мембраны появились в качестве альтернативных инструментов для исследований ионных каналов, 9,10 они также связаны с трудоемкими процессов и специальных знаний. Кроме того, мембраны восприимчивы к механическим возмущениям. Следовательно, липидные двухслойные технологии , введенные на сегодняшний день имеют ограниченные практические применения. 11
В целях повышения надежности и долговечности липидный бислой мембран, Костелло и др. , 12, и язь и Янагида <suр> 13 разработали свободно стоящую липидный бислой , поддерживаемый гидрогели. Несмотря на большей продолжительности жизни однако (<24 ч), двухслойная устойчивость не была улучшена. Джеон и др. 14 разработали гидрогеля инкапсулированный мембрану (подшить) с интимной гидрогель липидной двухслойной контакта, что приводит к большей продолжительности жизни (до нескольких дней). Для дальнейшего увеличения срока службы HEM, Malmstadt и Джеон и др. Создали гидрогель инкапсулированные мембрану с гидрогель-липидных связывания с помощью монолитного ковалентного сопряжения (cgHEM). 15 В обеих системах, мембранные времена жизни значительно увеличилось (> 10 дней) , Тем не менее, системы формирования мембрана не были достаточно прочными, и не могут быть сохранены или переданы, где это необходимо, чтобы освободить экспертизу для использования липидных бислоев.
Развитие липидной двухслойной платформы имеет в основном вращалась вокруг увеличения прочности и долговечности БЛМ. Хотя долговечность БЛМ был суbstantially усиливается в последнее время, их применение было ограничено из-за недостатка транспортабельности и способности к хранению. Чтобы преодолеть эти проблемы, Джеон и др. Создали Storable мембранную систему и введена мембранный предшественник (МП). 16 Для построения МП, они приготовили смесь н- деканом и гексадекану содержащей 3% -ную DPhPC (1,2-diphytanoyl- зп глицеро-3-фосфатидилхолин) , чтобы контролировать температуру замерзания липидного раствора таким образом, что она будет замерзать при ~ 14 ° C ( при температуре ниже комнатной, выше типичной температуре холодильника). В этом эксперименте МП растянулось на небольшое отверстие на политетрафторэтилен (ПТФЭ) пленку, а затем замораживают в холодильнике при температуре 4 ° С. Когда МП доводят до комнатной температуры, МП размораживают и липидный бислой был автоматически сформирован, устраняя опыт, как правило, связанный с образованием мембраны. Тем не менее, вероятность успеха BLM сделал из МП составляла всего ~ 27%, а мембраны формирования кп раз был непоследовательным (30 мин до 24 ч), что ограничивает его практическое применение.
В этом исследовании, полидиметилсилоксан (ПДМС), тонкая пленка используется вместо обычного гидрофобных тонких пленок (PTFE, полиоксиметилен, полистирол) до (а) времени, изготовления контроля и (б) увеличить вероятность успеха BLM формации, как сообщалось ранее Рю и др. 17 в данном случае формирование мембраны облегчается путем экстракции растворителей из – за пористой природы PDMS, и время , необходимое для формирования мембраны успешно контролируется в данном исследовании. В этой системе, как липидный раствор всасывается в тонкой пленке PDMS, последовательное время образования Мембрана была достигнута. Кроме того, срок службы мембраны был продлен из-за медленного поглощения растворителей в PDMS тонкопленочных, в результате добавления сквален к раствору липида. Мы провели оптические и электрические измерения, чтобы убедиться, что мембраны, полученные с помощью этой методики пригодны для гна каналах исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.
As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,20…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Pioneer Research Center Program (NRF-2012-0009575) and National Research Foundation Grants (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) from the National Research Foundation of Korea. This work was also partially supported by the Inha University Research Grant.
Materials
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
| Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
| 0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534———-K | To filter buffer solution |
| Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
| 500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
| CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
| Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
| Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
| Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
| Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
References
- Hanke, W., Schulue, W. . Planar lipid bilayers: methods and applications. , (2012).
- Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds. Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).
- Bayley, H., Cremer, P. S. Stochastic sensors inspired by biology. Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).
- Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery. Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).
- Majd, S., et al. Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).
- Kim, Y. R., et al. Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications. Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).
- Ryu, H., et al. Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes. Sci Rep. 5, (2015).
- Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J. Patch clamping by numbers. Drug. Discov. Today. 9 (10), 434-441 (2004).
- Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194, 979-980 (1962).
- Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).
- Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents. Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).
- Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. A robust gel-bilayer channel biosensor. Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).
- Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).
- Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. Hydrogel-encapsulated lipid membranes. J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).
- Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel. Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).
- Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform. Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).
- Ryu, H., et al. Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements. Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).
- Yaws, C. . Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals. , (1999).
- Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. . The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs. , (1976).
- Miller, C. . Ion Channel Reconstitution. , (1986).
- Miller, C. Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).
- Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers. Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).
- Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording. Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).
