Formación Automated bicapa lipídica membrana utilizando un polidimetilsiloxano Thin Film
Summary
Demostramos un sistema almacenable, transportable lípidos formación de bicapa. Una membrana de bicapa lipídica se puede formar dentro de 1 h con tasa de éxito más del 80% cuando un precursor de membrana congelada se llevó a temperatura ambiente. Este sistema reducirá los procesos laboriosos y conocimientos asociados a los canales iónicos.
Abstract
Una bicapa lipídica artificial, o membrana lipídica negro (BLM), es una poderosa herramienta para el estudio de los canales iónicos y la interacción de proteínas, así como para aplicaciones de biosensores. Sin embargo, las técnicas de formación de BLM convencionales tienen varios inconvenientes y que a menudo requieren conocimientos específicos y procesos laboriosos. En particular, BLM convencionales sufren de bajas tasas de éxito de formación y tiempo de formación de la membrana inconsistente. Aquí, se demuestra un sistema de formación de BLM almacenable y transportable con el tiempo de espera adelgazamiento controlado y velocidad de formación de BLM mejorada mediante la sustitución de películas utilizadas convencionalmente (politetrafluoroetileno, polioximetileno, poliestireno) de polidimetilsiloxano (PDMS). En este experimento, se usa un polímero poroso estructurado tal como una película delgada PDMS. Además, a diferencia de los disolventes usados convencionalmente con baja viscosidad, el uso de escualeno permite un tiempo de adelgazamiento de salida controlada por medio de absorción de disolvente lento por PDMS, prolongando la vida de la membrana. En anunciocondición, mediante el uso de una mezcla de escualeno y hexadecano, el punto de la solución de lípidos de congelación se incrementó (~ 16 ° C), además, se produjeron los precursores de membrana que se puede almacenar indefinidamente y fácilmente transportado. Estos precursores de membrana han reducido el tiempo BLM formación de <1 hora y se logró una tasa de formación de BLM de ~ 80%. Por otra parte, los experimentos de los canales iónicos con gramicidina A demostraron la viabilidad del sistema de membranas.
Introduction
Artificial membrana de bicapa lipídica, o membrana lipídica negro (BLM), es una herramienta importante para la aclaración de los mecanismos de las membranas celulares y los canales de iones, así como para la comprensión de las interacciones entre los canales iónicos e iones / moléculas. 1-7 Aunque el método de patch-clamp a menudo se considera el estándar de oro para los estudios de la membrana celular, es laboriosa y requiere operadores altamente calificados para las mediciones de los canales iónicos. 8 Aunque las membranas de bicapa lipídica reconstituidas artificialmente se han convertido en herramientas alternativas para los estudios de los canales iónicos, 9,10 también se asocian con laboriosa procesos y conocimientos específicos. Por otra parte, las membranas son susceptibles a perturbaciones mecánicas. Por lo tanto, las tecnologías de bicapa lipídica introducidas hasta la fecha han limitado las aplicaciones prácticas. 11
Con el fin de mejorar la robustez y la longevidad de las membranas bicapa de lípidos, Costello et al., 12, y Ide y Yanagida <sup> 13 han ideado una bicapa lipídica independiente con el apoyo de los hidrogeles. A pesar de una mayor longevidad sin embargo (<24 h), la robustez bicapa no mejoró. Jeon et al. 14 ideó una membrana de encapsulado de hidrogel (HEM) con íntimo contacto bicapa lipídica de hidrogel, lo que resulta en una mayor longevidad (hasta varios días). Para aumentar aún más la vida útil de la HEM, Malmstadt y Jeon et al. Crean una membrana de hidrogel encapsulado con la unión de hidrogel de lípidos a través de la conjugación covalente (cgHEM). 15 in-situ En ambos sistemas, tiempos de vida de la membrana aumentaron sustancialmente (> 10 días) . Sin embargo, los sistemas de formación de membrana no fueron lo suficientemente consistentes, y no se pueden guardar o entregados cuando sea necesario para liberar a la experiencia de uso de las bicapas lipídicas.
El desarrollo de una plataforma de bicapa lipídica ha girado principalmente en torno a aumentar la robustez y longevidad de BLM. Aunque la longevidad de BLM ha sido substantially mejorado recientemente, sus aplicaciones han sido limitados debido a la falta de capacidad de almacenamiento y facilidad de transporte. Para superar estos problemas, Jeon et al. Creado un sistema de membrana almacenable e introdujo un precursor de membrana (MP). 16 Para construir una MP, prepararon una mezcla de n-decano y hexadecano que contiene 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn -glicero-3-fosfatidilcolina) para controlar el punto de la solución de lípidos tal que se congelaría a ~ 14 ° C (por debajo de la temperatura ambiente, superior a la temperatura típica refrigerador) de congelación. En este experimento, la MP se extendió sobre una pequeña abertura en una película de politetrafluoroetileno (PTFE) y, posteriormente, congelado en un refrigerador a 4 ° C. Cuando el MP se llevó a temperatura ambiente, la MP descongela y una bicapa lipídica se formó automáticamente, eliminando la experiencia típicamente asociada con la formación de la membrana. Sin embargo, la tasa de éxito de la BLM a partir del MP fue tan baja como ~ 27%, y la membrana formation tiempo era incompatible (30 min a 24 h), lo que limita sus aplicaciones prácticas.
En este estudio, un polidimetilsiloxano (PDMS) de película fina se utiliza en lugar de un películas convencionales hidrófobos delgadas (PTFE, polioximetileno, poliestireno) a (a) el tiempo de control de fabricación y (b) aumentar la tasa de éxito de la formación de BLM como se informó anteriormente por Ryu et al. 17 en este documento, formación de la membrana fue facilitada por la extracción de disolventes debido a la naturaleza porosa de PDMS, y el tiempo requerido para la formación de membrana se controla con éxito en este estudio. En este sistema, como la solución de lípidos se absorbe en la película delgada PDMS, se consiguió un tiempo de formación de la membrana consistente. Por otra parte, la vida útil de la membrana se prolongó debido a la absorción lenta de disolventes en el PDMS película delgada, como resultado de la adición de escualeno a la solución de lípidos. Hemos llevado a cabo las mediciones ópticas y eléctricas para verificar que las membranas formadas utilizando esta técnica son adecuados para ien estudios de canales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.
As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,20…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Pioneer Research Center Program (NRF-2012-0009575) and National Research Foundation Grants (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) from the National Research Foundation of Korea. This work was also partially supported by the Inha University Research Grant.
Materials
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
| Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
| 0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534———-K | To filter buffer solution |
| Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
| 500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
| CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
| Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
| Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
| Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
| Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
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