Automatiseret lipiddobbeltlagsmembranen Formation Ved hjælp af en Polydimethylsiloxan Thin Film
Summary
Vi demonstrerer en kan lagres, transportabelt lipiddobbeltlag dannelse system. En lipiddobbeltlagsmembranen kan dannes inden for 1 time med over 80% succesrate når en frossen membran precursor er bragt til omgivelsestemperatur. Dette system vil reducere besværlige processer og ekspertise, der er forbundet med ionkanaler.
Abstract
En kunstig lipiddobbeltlag eller sorte lipidmembranen (BLM), er et stærkt værktøj til at studere ionkanaler og protein-interaktioner, samt til biosensoranvendelser. Men konventionelle BLM dannelse teknikker har flere ulemper og de ofte kræver særlig ekspertise og arbejdskrævende processer. Især lider konventionelle BLMs fra lave dannelse succesrate og inkonsekvent dannelse membran tid. Her demonstrerer vi en oplagres og transportabelt BLM dannelse systemet med styret udtynding-out tid og forbedret BLM dannelse sats ved at erstatte konventionelt anvendte film (polytetrafluorethylen, polyoxymethylen, polystyren) til polydimethylsiloxan (PDMS). I dette forsøg er en porøs struktureret polymer, såsom PDMS tynd film anvendes. Derudover, i modsætning til konventionelt anvendte opløsningsmidler med lav viskositet, anvendelse af squalen tilladt en styret udtynding-ud via langsom absorption opløsningsmiddel ved PDMS, forlænger membran levetid. I annoncenbetingelse, ved anvendelse af en blanding af squalen og hexadecan, frysepunktet af lipidopløsning blev forøget (~ 16 ° C), blev desuden fremstillet membran forstadier, der kan ubestemt tid opbevares og let transporteres. Disse membran forstadier har reduceret BLM dannelse tid <1 time og opnåede en BLM dannelse på ~ 80%. Endvidere ionkanal-eksperimenter med gramicidin A demonstrerede gennemførligheden af membransystemet.
Introduction
Kunstig lipiddobbeltlagsmembran, eller sort lipidmembranen (BLM), er et vigtigt redskab til at belyse mekanismerne i cellemembraner og ionkanaler, samt for at forstå samspillet mellem ionkanaler og ioner / molekyler. 1-7 Skønt patch-clamp-metoden er ofte betragtes som den gyldne standard for cellemembran undersøgelser, det er besværligt og kræver dygtige operatører for ionkanal-målinger. 8. Mens kunstigt rekonstituerede lipiddobbeltlagsmembraner er dukket op som alternative værktøjer til ionkanal-studier, 9,10 de er også forbundet med besværlige processer og særlig ekspertise. Desuden membraner er modtagelige for mekaniske forstyrrelser. Derfor har lipiddobbeltlag teknologier, der indføres til dato begrænsede praktiske anvendelser. 11
For at øge robustheden og levetiden af lipiddobbeltlagsmembraner, Costello et al. 12, og Ide og Yanagida <sup> 13 har udtænkt en fritstående lipiddobbeltlaget understøttet af hydrogeler. Trods forbedret levetid dog (<24 timer), blev dobbeltlag robusthed ikke forbedret. Jeon et al. 14 udtænkt en hydrogel indkapslet membran (HEM) med intim hydrogel-lipiddobbeltlag kontakt, hvilket resulterer i forøget levetid (op til flere dage). For yderligere at forøge levetiden af HEM, Malmstadt og Jeon et al. Skabte en hydrogel-indkapslet membran med hydrogel-lipid binding via in-situ kovalent konjugering (cgHEM). 15 I begge systemer, membran levetider forbedret betydeligt (> 10 dage) . Men dannelse membran systemer var ikke tilstrækkeligt robuste, og kunne ikke opbevares eller leveret, hvis det kræves for at befri ekspertise til brug af lipid dobbeltlag.
Udviklingen af et lipiddobbeltlag platform har primært drejet sig stigende robusthed og levetiden af BLMs. Selv levetiden af BLMs har været substantially forbedret nylig har deres ansøgninger været begrænset på grund af mangel på transporterbart og lagerholdbarhed. For at overvinde disse problemer, Jeon et al. Skabt et lagres membransystem og introducerede en membran forløber (MP). 16 at konstruere et parlamentsmedlem, de forberedt en blanding af n-dekan og hexadecan indeholder 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn-glycero-3-phosphatidylcholin) til styring af frysepunkt lipidopløsning sådanne, at det fryser ved ~ 14 ° C (under stuetemperatur, over typiske køleskabstemperatur). I dette forsøg blev MP spredt over en lille åbning på en polytetrafluorethylen (PTFE) film og efterfølgende frosset i et køleskab ved 4 ° C. Når MP blev bragt til stuetemperatur, MP optøet og et lipiddobbeltlag blev automatisk dannet, hvilket eliminerer ekspertise typisk er forbundet med dannelse membran. Men succesraten for BLM lavet fra MP var så lav som ~ 27%, og membran GERn gang var inkonsekvent (30 min til 24 timer), hvilket begrænser den praktiske anvendelse.
I denne undersøgelse er en polydimethylsiloxan (PDMS) tynd film anvendes i stedet for en konventionel hydrofobe tynde film (PTFE, polyoxymethylen, polystyren) til (a) kontrol fabrikation tid og (b) øge succesraten af BLM dannelse som tidligere rapporteret af Ryu et al. 17. Heri dannelse membran blev lettet ved ekstraktion af opløsningsmidler på grund af den porøse beskaffenhed af PDMS, og den tid, der kræves til dannelse membran blev med held styret ved denne undersøgelse. I dette system, som det lipidopløsning blev absorberet i PDMS tynd film, blev en konsistent membrandannelse tid opnået. Desuden blev membran levetid forlænget på grund af langsom absorption af opløsningsmidler i PDMS tyndfilm, et resultat af tilsætning af squalen til lipid løsning. Vi har udført optiske og elektriske målinger for at kontrollere, at membraner dannet ved anvendelse af denne teknik er egnet til ipå kanaler studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.
As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,20…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Pioneer Research Center Program (NRF-2012-0009575) and National Research Foundation Grants (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) from the National Research Foundation of Korea. This work was also partially supported by the Inha University Research Grant.
Materials
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
| Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
| 0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534———-K | To filter buffer solution |
| Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
| 500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
| CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
| Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
| Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
| Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
| Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
References
- Hanke, W., Schulue, W. . Planar lipid bilayers: methods and applications. , (2012).
- Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds. Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).
- Bayley, H., Cremer, P. S. Stochastic sensors inspired by biology. Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).
- Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery. Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).
- Majd, S., et al. Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).
- Kim, Y. R., et al. Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications. Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).
- Ryu, H., et al. Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes. Sci Rep. 5, (2015).
- Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J. Patch clamping by numbers. Drug. Discov. Today. 9 (10), 434-441 (2004).
- Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194, 979-980 (1962).
- Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).
- Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents. Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).
- Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. A robust gel-bilayer channel biosensor. Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).
- Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).
- Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. Hydrogel-encapsulated lipid membranes. J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).
- Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel. Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).
- Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform. Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).
- Ryu, H., et al. Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements. Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).
- Yaws, C. . Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals. , (1999).
- Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. . The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs. , (1976).
- Miller, C. . Ion Channel Reconstitution. , (1986).
- Miller, C. Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).
- Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers. Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).
- Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording. Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).
