Desenvolvimento de um Sistema Insert Co-cultura de dois tipos celulares na ausência de célula-célula Contact

Summary

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Abstract

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

Introduction

O estudo de tecidos, órgãos ou sistemas in vitro é uma tentativa para simplificar os relacionamentos existentes muito complexas entre os vários subtipos celulares que compreendem organismos multicelulares. De facto, estudos in vitro tornam possível adquirir uma compreensão detalhada das populações de células individuais. Existem duas grandes vantagens da realização de experiências in vitro: 1) reduzidas interacções celulares, e 2) a capacidade de manipular facilmente o ambiente celular. Cientistas Assim, estas duas vantagens permitiram prever o comportamento de tipos específicos de células in vivo, levando a capacidade para regular os resultados de influências extrínsecos em organismos inteiros. Nesse sentido, em cultura de células in vitro muitas vezes funciona como uma ponte de ligação entre ciências básicas e aplicadas de vida. No entanto, também existem várias desvantagens de se trabalhar in vitro, o mais importante sendo que uma certa reserva pode habitar na fisiológicoal relevância dos fenótipos observados. Com efeito, quando um único tipo de célula é cultivada num vaso, a cultura perde, em graus diversos,, as suas ligações célula-célula com outros tipos de células, a sua contribuição para o ambiente humoral a partir do tecido e organismo de origem, e as âncoras dentro o tecido que lhe permitiu manter uma estrutura tridimensional em particular, por vezes crucial para a função da célula.

A questão da relação célula-célula foi abordada pelo desenvolvimento de técnicas de cultura mista. Neste método, duas ou mais populações de células são cultivadas em conjunto no mesmo vaso de cultura. No entanto, estas culturas mistas suportar inconvenientes importantes. Por um lado, alguns subtipos de células não interagem fisicamente com o outro no tecido de origem e depender unicamente das comunicações parácrinos sustentadas por fatores solúveis secretados e receptores nas proximidades. Este é o caso de vários processos inflamatórios que dependem da sinalização de citocina proximal. Em c mistaultures, interações físicas são inevitáveis ​​e torná-lo impossível estudar comunicações parácrinos na ausência de contatos célula-célula que podem produzir resultados alterados. Por outro lado, a realização interpretações específicos de células a partir de uma população mista torna-se inviável sem o uso de técnicas de separação duras que poderiam afectar de forma significativa os resultados.

Para resolver estes problemas importantes, a utilização de meios condicionados foi desenvolvido como uma técnica que permite culturas compartimentadas e o estudo da sinalização parácrina. Este método exige a transferência do sobrenadante de um tipo de células, o meio condicionado assim nomeados, às cavidades contendo outra população de células. No entanto, uma desvantagem importante é que as moléculas de vida curta não sobreviver o tempo suficiente no meio condicionado para ser transferida para os poços da segunda população de células. Mesmo moléculas de longa vida será muito diluídas ao longo do tempo devido à difusão. Além disso, tanto celularpopulações só participam na comunicação parácrina unidirecional e não em comunicação bidirecional ativa. Isto conduz à ausência de sinalização de feedback que é vital para recriar relações precisas multicelulares como elas existem in vivo.

Em consequência e motivado pela necessidade para melhor simular o original em condições in vivo no ambiente celular in vitro, a vários avanços nas técnicas de cultura de células foram obtidos ao longo dos anos. Um dos avanços mais significativos foi o uso de suportes permeáveis ​​com membranas microporosas para compartimentar culturas de células, utilizadas pela primeira vez por Grobstein em 1953 ^um. Tais suportes permeáveis ​​foram adaptados ao longo dos anos para acomodar vários tipos de células e para ser utilizada em várias aplicações diferentes. Hoje em dia, estes suportes existem inserções como ocos que são destinadas para descansar em poços de uma placa de cultura de tecido de poços múltiplos ou em circupratos Lar. Em um sistema de co-cultura, a inserção contém um tipo de célula ao passo que o poço ou prato contém a outra população celular, permitindo estudar a contribuição de duas populações diferentes de células no seu meio ambiente humoral (Figura 1). Como resultado, a polaridade celular (basolateral vs secreção apical ou a recepção do sinal) é preservada, conferindo, assim, sistemas de co-cultura inserir uma vantagem importante sobre as culturas mistas e técnicas de meio condicionado. Vários tipos de materiais de membrana estão disponíveis, as mais comuns sendo de poliéster (PET), policarbonato (PC) ou revestidos com colagénio de politetrafluoretileno (PTFE), e existem em diferentes tamanhos de poros variando de 0,4 um a 12,0 um. Estas variedades de materiais e tamanhos de poros oferecer um espectro de inserções exercendo características variáveis ​​relevantes para propriedades ópticas, a espessura da membrana e adesão celular que tornam prático a níveis diferentes para as seguintes utilizações não limitados a:
-estudandoa diferenciação celular, o desenvolvimento embrionário, a metástase tumoral e reparação de feridas por ensaios de quimiotaxia através de membranas permeáveis;
-evaluating penetração da droga, avaliando o seu transporte através de monocamadas epiteliais ou endoteliais cultivadas em suportes permeáveis, e;
-performing celulares co-culturas para analisar modulações comportamento celular induzida por factores solúveis segregadas na ausência de contacto célula-célula.

O objetivo deste artigo é descrever orientações metodológicas gerais para cumprir a terceira função dito acima, que é o de avaliar as alterações celulares mediadas por fatores solúveis secretados na ausência de contato célula-célula usando um sistema de co-cultura de inserção. Vários campos diferentes de pesquisa fazem uso de sistemas de co-cultura de inserção, a fim de responder a questões relevantes para o efeito de fatores solúveis secretados em populações de células. Com efeito, a sinalização parácrina que modula o comportamento celular em vários níveis é pertinente em todos os tecidose dos sistemas, o que torna os sistemas de co-cultura de inserção indispensável para garantir avanços nestes domínios. Por outro lado, a utilização de inserções pode confirmar que a transdução de sinal é por contacto directo célula a célula e não por factores segregados. Uma das utilizações mais importantes de inserções é em estudos de inflamação ^2-14, onde o efeito de citocinas secretadas é avaliada em vários agentes celulares de imunidade. Em particular, o estudo da inflamação no sistema nervoso central (SNC) tem muito lucraram com estudos co-cultura de inserção, que têm permissão para definir melhor os papéis parácrinos distintos de neurônios e microglia na condução neuroinflamação ^15-21. Estes sistemas também foram concebidos para estudar o potencial anti-inflamatório de moléculas que se baseia na sua capacidade de reduzir ou inibir a secreção de factores pró-inflamatórias ^22-26. Investigação referentes ao câncer de ^27-31, em particular os mecanismos subjacentes a angiogênese ^32-34 e inflammatiem ^35-42 na tumorigênese, também se beneficia de sistemas de co-cultura de inserção. Além disso, fatores solúveis são de primordial importância nos processos que impulsionam diferenciação e vários estudos têm usado as inserções para responder às perguntas em que determinado campo de ^43-50. No SNC, visto que o tecido neural tem um potencial de renovação muito limitado, o estudo de neurotrophism e neuroprotecção é fundamental e tem sido amplamente assegurada pela utilização de células estaminais em sistemas de co-cultura de ^51-56. Além disso, inserções também são utilizados em diversos campos como a nefrologia ^57,58, interacções endoteliais e angiogênese ^59-62, apoptose sinalização ^63-65, inflamação na obesidade e síndrome metabólica ^22,23,66-67, ouvido interno protecção das células ciliadas ^68,69, e até mesmo em fungos virulência ^70,71 e parasitologia ^72,73.

Este artigo oferece orientações metodológicas gerais, a fim de criar um experiment, tendo em vista avaliar as alterações celulares mediadas por fatores solúveis secretados usando um sistema de co-cultura de inserção. Em particular, vamos concentrar a nossa atenção em co-culturas de células nervosas e seus usos em estudar processo neuroinflamatória. Dada a muito vasto espectro de experiências que insere tornar possível piloto, é insuportável para cobrir todos os aspectos desta técnica de cultura de células. Como um exemplo, um protocolo específico para medir os efeitos de citocinas secretadas por lipopolissacárido (LPS) -activated microglia N9 em células PC12 neuronais será detalhado, oferecendo uma compreensão concreta da metodologia de co-cultura de inserção.

Protocol

Nota: Cada um dos seguintes passos devem ser realizados sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar, conforme necessário para a cultura de células de mamífero. Além disso, as orientações gerais para a cultura de células estéril optimizada aplica-se, por exemplo., Descartando dicas qualquer momento que eles podem levar à contaminação cruzada, reduzindo a quantidade de células de tempo são expostos ao ar ao realizar mudanças de suporte inteiras, adequadamente, mas que se agitava suavemen…

Representative Results

O uso de sistemas de co-cultura de inserção é particularmente pertinente no estudo de processos neuroinflamat�ios que mostram relações parácrinos entre diferentes jogadores celulares do CNS. Imunidade no SNC é realizado principalmente por células residentes chamadas microglia que monitoram seu ambiente em seu estado de repouso ramificada (Figura 2A) e são capazes de distúrbios sentindo que poderia incomodar a homeostase muito precioso necessário para a fu…

Discussion

O passo mais crítico de toda a experiência do sistema de co-cultura inserção realmente habita em escolher a inserção correta de usar. O tamanho dos poros e material de membrana tem de ser tida em conta completa, sem deixar de considerar o tipo de células que irão ser semeadas e o objectivo da experiência. Por exemplo, ensaios de quimiotaxia podem utilizar o mesmo tipo de membrana de co-culturas de células para analisar modulações comportamento celular induzida por factores solúveis segregadas na ausência d…

Materials

RPMI-1640 medium	Sigma	R8755	Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma	D6421	Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine
Horse serum	ATCC	30-2040	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum	MultiCell	80350	Warm in 37 °C water bath before use
Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland	Sigma	N0513	Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm in 37 °C water bath before use
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5	Sigma	L2880	Toxic
Cell culture inserts for use with 24-well plates	BD Falcon	353095	0.4 μm pores
24-well plates	TrueLine	TR5002	Coat with collagen before use
Routine PC12 cell culture medium			Routine N9 cell culture medium
-       85% RPMI medium			-       90% DMEM-F12 medium
-       10% heat-inactivated horse serum			-       10% heat-inactivated horse serum
-       5% heat-inactivated fetal bovine serum
PC12 differentiation medium			N9 treatment medium
-        99% RPMI medium			-       99% DMEM-F12 medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum			-       1% heat-inactivated horse serum
-        50 ng/mL nerve growth factor
PC12 treatment medium
-        99% RPMI medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum