Разработка Вставка совместного культивирования системы двух клеточных типов в отсутствие межклеточных контактов

Summary

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Abstract

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

Introduction

Изучение тканей, органов или систем в пробирке является попыткой упростить очень сложные отношения , существующие между несколькими сотовыми подтипов , которые включают многоклеточные организмы. Действительно, в пробирке исследования позволяют получить детальное представление о популяции отдельных клеток. Есть два основных преимущества проведения в лабораторных экспериментах: 1) уменьшение клеточных взаимодействий, и 2) способность легко манипулировать клеточной среде. Таким образом, эти два преимущества позволили ученым предсказать поведение конкретных типов клеток в живом организме , что приводит к способности регулировать результаты внешних влияний в целых организмах. В этом смысле, в пробирке культуры клеток часто работает в качестве моста , соединяющего фундаментальных и прикладных наук о жизни. Тем не менее, есть и несколько недостатков работы в лабораторных условиях , наиболее важным из них в том , что определенная оговорка может пребывать в физиологическомаль значимость наблюдаемых фенотипов. В самом деле, когда один тип клеток выращивают в сосуде, культура теряет, в разной степени, его межклеточные соединения с другими типами клеток, его вклад в гуморальной среде из ткани и организма происхождения, а также якорей в пределах ткани, что позволило ему поддерживать определенную трехмерную структуру, иногда решающее значение для функции клеток.

Вопрос о межклеточных отношений была решена развитием смешанных методов культуры. В этом способе две или более клеточных популяций выращивают вместе в той же культурального сосуда. Тем не менее, эти смешанные культуры несут важные неудобства. С одной стороны, некоторые клеточные подтипы физически не взаимодействуют друг с другом в ткани происхождения и полагаться только на паракриновых связи понесенных секретируемых растворимых факторов и соседних рецепторов. Это случай для нескольких воспалительных процессов, которые зависят от проксимального сигнализации цитокина. В смешанном Cultures, физические взаимодействия неизбежны и сделать невозможным изучение паракринной связи в отсутствие межклеточных контактов, которые могут дать измененные результаты. С другой стороны, достижение клеточно-специфической интерпретации внутри смешанной популяции становится невозможным без использования жестких методов разделения, которые могут существенно повлиять на результаты.

Для решения этих важных вопросов, использование кондиционированной среды была разработана в качестве метода, позволяющего для разобщенным культур и изучения паракринной сигнализации. Этот метод требует передачи супернатанта одного типа клеток, так назвали кондиционированной среды, в лунки, содержащие другую популяцию клеток. Тем не менее, существенным недостатком является то, что короткоживущие молекулы не достаточно долго, в кондиционированной среде, чтобы быть переданы в лунки второго популяции клеток. Даже долгоживущие молекулы будут сильно разбавленный с течением времени за счет диффузии. Кроме того, обе ячейкинаселения участвуют только в одном направлении паракринному коммуникации, а не в активной двунаправленной связи. Это приводит к отсутствию сигналов обратной связи , которая имеет жизненно важное значение в воссоздании точных многоклеточные отношения , как они существуют в естественных условиях.

Как следствие , и движимый необходимостью лучше имитировать оригинал в условиях естественных условиях в клеточной среде в пробирке, несколько методов достижения в области клеточных культур были достигнуты на протяжении многих лет. Одним из наиболее значительных достижений было использование проницаемых штативов с микропористых мембран для compartmentalizing клеточных культур, используемых в первый раз по Grobstein в 1953 году ^1. Такие проницаемые опоры были адаптированы на протяжении многих лет для размещения многочисленных типов клеток , и которые будут использоваться в нескольких различных приложений. В настоящее время, эти опоры существуют в виде полых вставок, которые предназначены для отдыха в скважинах из тканевой культуры пластины многоямного или в CircuLAR блюда. В системе со-культуры, вставка содержит один тип клеток , тогда как колодец или блюдо содержит другой клеточной популяции, что позволяет изучать вклад двух различных популяций клеток на их гуморального среды (рисунок 1). В результате, клеточная полярность (базолатеральная против апикальной секреции или приема сигнала) сохраняется, таким образом, присвоение Systems вставки сокультуре важное преимущество перед смешанных культур и кондиционированную среду методов. Несколько типов мембранных материалов доступны, наиболее распространенными из которых являются полиэстер (PET), поликарбонат (PC) или коллаген покрытием из политетрафторэтилена (PTFE), и они существуют в различных размеров пор в диапазоне от 0,4 мкм до 12,0 мкм. Эти разновидности материалов и размеров пор предлагают спектр вставок воздействует переменным функции, имеющие отношение к оптическим свойствам, толщины мембраны и присоединение клеток, которые делают их практичными на различных уровнях для следующих видов применения, не ограничиваясь ими:
-studyingклеточной дифференцировки, эмбриональное развитие, метастазирование опухолей и заживлении ран путем хемотоксических анализов через проницаемые мембраны;
-evaluating проникновения наркотиков путем оценки их переноса через эпителиальные или эндотелиальные монослои культивировали на проницаемые опорах, и;
-performing клеточные сокультурах для анализа модуляций поведение клеток, индуцированные секретируемых растворимых факторов, в отсутствии межклеточного контакта.

Цель данной статьи состоит в том, чтобы описать общие методические указания для выполнения третьей функции указанной выше, то есть оценить клеточные изменения, опосредованные секретируемых растворимых факторов при отсутствии межклеточного контакта, используя систему вставки совместного культивирования. Несколько различных направления исследований, систем использования вставки совместно культуры для того, чтобы ответить на вопросы, относящиеся к действию секретируемых растворимых факторов на популяции клеток. Действительно, паракринная сигнализации, который модулирует клеточный поведение на различных уровнях уместен во всех тканяхи систем, что делает вставки системы совместного культивирования незаменим для обеспечения прогресса в этих областях. С другой стороны, использование вставок может подтвердить, что преобразование сигналов является прямым контактом межклеточной и не секретируемых факторов. Одним из наиболее важных областей применения вставок в исследованиях воспаления ^2-14 , где эффект секретируемых цитокинов оценивается в различных клеточных игроков иммунитета. В частности, исследование воспаления в центральной нервной системе (ЦНС) значительно выгоду от исследований вставки совместно культуры, которые позволили более четкому определению различных паракринной роли нейронов и микроглии в вождении нейровоспаления ^15-21. Эти системы были разработаны также изучить противовоспалительный потенциал молекул , который зависит от их способности снижать или ингибировать секрецию провоспалительных факторов ^22-26. Исследования , относящиеся к раку ^27-31, в частности , механизмы , лежащие в основе ангиогенез ^32-34 и inflammatiна ^35-42 в онкогенеза, также извлекает выгоду из систем вставки совместного культивирования. Кроме того, растворимые факторы имеют первостепенное значение в процессах , которые управляют дифференцировка и несколько исследований использовали вставки , чтобы ответить на вопросы в этой конкретной области ^43-50. В ЦНС, видя , как нервная ткань имеет очень ограниченный потенциал обновления, изучение neurotrophism и нейропротекции является фундаментальным и широко обеспечивается за счет использования стволовых клеток в системах совместного культивирования ^51-56. Кроме того, вставки также используются в качестве различных областях , как нефрологии ^57,58, эндотелиальных взаимодействий и ангиогенеза ^{59-62, 63-65} апоптоз сигнализации, воспаление ожирения и метаболического синдрома ^22,23,66-67, внутреннего уха защиты волосковых клеток ^68,69, и даже в вирулентности гриба ^70,71 и ^72,73 паразитологии.

В данной статье общие методические указания для того, чтобы создать experimлор ввиду оценки клеточных изменений, опосредованных секретируемых растворимых факторов, с использованием системы вставки сокультивирования. В частности, мы сосредоточим наше внимание на нервных клеток со-культур и их использования в учебном процессе нейрогенный. С учетом весьма обширный спектр экспериментов, которые вставляет позволяют пилоту, это невыносимо, чтобы охватить все аспекты этого метода клеточной культуры. В качестве примера, конкретный протокол для измерения эффектов цитокинов, секретируемых липополисахарида (LPS) -активированную N9 микроглии на нейрональных клетках РС12 будут подробно, предлагая конкретное понимание методологии вставки сокультуры.

Protocol

Примечание: В каждом из следующих шагов должны быть выполнены в стерильных условиях в вытяжном шкафу с ламинарным потоком воздуха, как требуется для культуры клеток млекопитающих. Кроме того, общие принципы для оптимального выращивания стерильной клетки применяются, например., О?…

Representative Results

Использование вставных систем совместного культивирования особенно актуально при изучении нейровоспалительных процессов, которые наглядно демонстрируют паракринной взаимосвязи между различными сотовыми игроками центральной нервной системы. Иммунитет в ЦНС осущ…

Discussion

Самым важным шагом любой системы эксперимента вставка сокультуры на самом деле живет в выборе правильной вставки для использования. Размер пор и материал мембраны должен быть принят во внимание тщательной, не забывая учитывать тип клеток, которые будут посеяны и цель эксперимента. На?…

Materials

RPMI-1640 medium	Sigma	R8755	Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma	D6421	Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine
Horse serum	ATCC	30-2040	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum	MultiCell	80350	Warm in 37 °C water bath before use
Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland	Sigma	N0513	Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm in 37 °C water bath before use
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5	Sigma	L2880	Toxic
Cell culture inserts for use with 24-well plates	BD Falcon	353095	0.4 μm pores
24-well plates	TrueLine	TR5002	Coat with collagen before use
Routine PC12 cell culture medium			Routine N9 cell culture medium
-       85% RPMI medium			-       90% DMEM-F12 medium
-       10% heat-inactivated horse serum			-       10% heat-inactivated horse serum
-       5% heat-inactivated fetal bovine serum
PC12 differentiation medium			N9 treatment medium
-        99% RPMI medium			-       99% DMEM-F12 medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum			-       1% heat-inactivated horse serum
-        50 ng/mL nerve growth factor
PC12 treatment medium
-        99% RPMI medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum