Protocol
הפרוטוקול צריכה להתבצע בהתאם קפדן עם חקיקה לאומית ובינלאומית ולתקנות מקומיות. דם מתורמים בריאים כי נתנו את הסכמתם לתרום דם למטרות המחקר כבר המתקבל מרכזי עירוי דם שבה מוסדות חתמו הסכם. הגנות מיוחדות יש לנקוט בעת מדמם של בני האדם. ניסויים עם HIV-1 חייבים להתבצע ברמת בטיחות ביולוגית 3 או 2 (BSL-3 או 2) מעבדה על פי תקנות מקומיות.
1. הכנת האדם מונוציטים הנגזרות המקרופאגים (hMDMs) לפי צפיפות Gradient צנטריפוגה בחירה על ידי הדבקה
- התחל עם דם טרי מתורמים בריאים (9 מ"ל). לדלל את כל נפח של דם טרי עם בופר פוספט 1x סטרילי (PBS) ללא Ca 2 + ו Mg 2+ להשיג נפח סופי של 70 מ"ל בעדינות להוסיף את דם מדולל לשני צינורות חרוטי 50 מ"ל (35 מ"ל לכל צינור) , על גבי 15 מ"ל שלeutral, מסועף מאוד, גבוה המוני, פוליסכריד הידרופילי בתמיסה כבר בצינור אחד.
- צנטריפוגה שני צינורות דם ב 537 XG במשך 20 דקות ב 20 ° C ללא בלם. ואז לאסוף את התאים דם היקפיים mononuclear (PBMCs) הכלול טבעת תא מעונן בממשק ולהעביר אותם לתוך צינור חדש 50 מ"ל המכיל 15 מ"ל של 1x PBS ללא Ca 2 + ו Mg 2+.
- צנטריפוגה התאים ב 218 XG במשך 5 דקות ב 20 ° C ו resuspend גלולה ב 45 מ"ל של PBS 1x ללא Ca 2 + ו Mg 2+.
- צנטריפוגה התאים ב 218 XG במשך 5 דקות ב 20 מעלות צלזיוס, resuspend גלולה ב 10 מ"ל של 1x PBS ללא Ca 2 + ו Mg 2+, ולספור את התאים על ידי דילול לדילול הסופי של 1/200 ב Trypan כחול.
- צנטריפוגה התאים ב 218 XG במשך 5 דקות ב 20 ° C ו resuspend גלולה ב RPMI (מכון ממוריאל פארק Roswell) בינוני 1640 בתוספת 2 מ"מ L- גלוטמין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל penicillin סטרפטומיצין יש 7 x 10 6 PBMCs לכל היטב 2 מ"ל של מדיום בכל טוב של צלחת גם 6.
- דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 על 2 hr. אחרי שעה 2 מונוציטים יהיה דבקו פלסטיק.
- כדי לאפשר מונוציטים טרי-מבודד להתמיין hMDMs, לשאוב את המדיום ולהחליף אותו עם 2 מ"ל hMDM בינוני (RPMI 1640, 10% decomplemented עוברית עגל בסרום (FCS), 2 מ"מ L- גלוטמין ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין) בתוספת המושבה Macrophage אנושי רקומביננטי פקטור מגרה (RHM-CSF) בריכוז סופי של 10 ng / ml.
- דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 עבור 11 ימים (איור 1).
- באותו יום 11 להסיר את בינוני לשטוף 2 פעמים עם 2 מ"ל של מדיום hMDM קר לכל טוב. הבא לשטוף היטב כל 2 פעמים עם 1 מ"ל של PBS 1x קר.
- כדי לנתק hMDMs הבדיל באופן מלא, לשטוף היטב בכל פעם 1 עם 1 מ"ל של PBS 1x קר עם 2 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetatic (EDTA) דגירה התאים 2 מ"ל של PBS 1x קר עם 2 מ"מ EDTA לכל טוב עבור 15-60 דקות ב 4 °.
הערה: שיטות חלופיות כדי לנתק את התאים קיימים (למשל, טריפסין או פעילויות כמו טריפסין) שעשוי לתת תוצאות טובות 11. - לאחר ניתוק (הושלמה על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה הבאר), לאסוף את התאים ולשים אותם בתוך שפופרת 50 מ"ל על הקרח המכיל 10 מ"ל של מדיום hMDM קר.
- צנטריפוגה התאים ב 218 XG במשך 5 דקות ב 20 מעלות צלזיוס, resuspend גלולה ב 10 מ"ל של מדיום hMDM קר, ולספור את התאים על ידי דילול 1/20 ב Trypan כחול.
- זרעי התאים ב 1 x 10 6 hMDMs לכל צלחת תחתית זכוכית כיתת מיקרוסקופיה 35 מ"מ ו דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 עבור 1 יום.
2. הפקה וכימות של HIV-1 מניות ויראלי
הערה: NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) נושא מעטפה R5-טרופי, מתנה מ Schindlאה 10 משמש להדביק מאקרופאגים לראות תאים נגועים בזמן אמת.
- תוצרת מניות ויראלי על ידי transfection של תאים 293T כליה עובריים אנושיים (2 x 10 6 בצלחת מ"מ 100) עם 6 מיקרוגרם של ה- DNA proviral המתאים באמצעות מגיב transfection מסחרי.
- לכמת את ההדבקה של המניות וירוס באמצעות תאים אינדיקטור הלה TZM-bl (הנושאת את הגן SS-galactosidase בשליטת HIV-1 LTR) באמצעות דילולים סדרתי של מניות ויראלי ואחריו צבע SS-galactosidase של תאים ועוד היד נטויה של כחול תאי 12.
זיהום 3. hMDMs עם HIV-1
- מוסיפים את הנגיף על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) 0.02-0.03 ב 1 מ"ל של מדיום hMDM כדי hMDMs (תאים מצופה ב 1.13). כדי לשלוט בארות להוסיף רק 1 מ"ל של מדיום hMDM דגירה מנות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 על 2 ימים (איור 1).
- באותו יום 2 לשטוף את התאים עם hMDM medium 3 פעמים ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום hMDM טריים לכל צלחת. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 עבור 6 ימים (איור 1).
4. Opsonization של כדוריות דם אדומות כבשים
- להכנת 7 x 10 6 SRBCs לכל צלחת, לשטוף את SRBCs שתי פעמים 100 μl של תמיסה המכילה 0.1% שור סרום אלבומין (BSA) ב 1x PBS עם צנטריפוגה ב 600 XG למשך 4 דקות.
- Resuspend את SRBCs לרחוץ 500 μl 1x PBS / BSA 0.1% עם ארנב IgG אנטי SRBCs בריכוז תת-agglutinating לכל 5 μl של SRBCs דגירה עם סיבוב ב RT במשך 30 דקות.
הערה: כדי לקבוע את הריכוז תת-agglutinating של IgG אנטי SRBCs, להכין דילולים הסידורי של IgG (ריכוז המניה ב 13.1 מ"ג / מ"ל) מ 1/50 ל -1 / 25,600 ב 20 μl בצלחת 96-היטב. להוסיף 2 x 10 6 SRBCs ב 20 μl בכל טוב ולשים את הצלחת בחדר חשוך במשך כמה שעות. הריכוז תת-agglutinating הואדילול של הבאר רק לפני הבאר עם ההתלכדות (IgG + SRBCs ויצרה רשת). - לאחר הסיבוב, בצנטריפוגה IgG-opsonized-SRBCs ב 600 XG למשך 4 דקות ולשטוף עם 100 μl של PBS 1x / BSA 0.1% עם צנטריפוגה ב 600 XG למשך 4 דקות.
- Resuspend את IgG-opsonized-SRBCs במדיום מראש חימם פנול אדום ללא RPMI בתוספת 2 מ"מ L- גלוטמין ו -1%, סטרפטומיצין פניצילין (1 מ"ל / צלחת).
5. תא חי Assay המיקרוסקופית וידאו Phagocytosis
- השתמש במערכת הדמיה confocal כגון מערכת דיסק מסתובב מצויד בתא חימום על 37 מעלות צלזיוס עם CO 2 עובר דרך בקבוק עם מים עבור humidification.
- הפעילו את תא חימום לפני הניסוי לקבל את הבמה מיקרוסקופ על 37 מעלות צלזיוס לפני תחילת assay phagocytosis. הפעל מיקרוסקופ ומחשב, ולטעון את תוכנת ההדמיה.
- מטב את הגדרות הדמיה כגון מהירות סריקה, מגניפיקטיון, רזולוציה, וכו 'יש תא אחד לפחות לכל שדה וכדי מסגרת תמונה אחת בכל דקה בין 60 עד 120 דקות.
הערה: כאן, המדגם הוא צלם מסגרת אחת בכל דקה במהלך 60 דקות עם 63X עדשה. - מניחים את צלחת הדמיה על הבמה מיקרוסקופ. התאם את המיקוד ואת המיקום למצוא רק אחת שלם מקרופאג נגוע ב- HIV-1 בתחום. השתמש בהגדרות עירור מתאימות / פליטה המבוססות על מערכת ההדמיה המשומשת חללית. כלול ערוץ שדה (BF) בהיר להתבונן phagosomes (איור 1ii). מטב את המראה של תמונות בערוץ השונות על ידי התאמת אחוז זמן אור וחשיפה המשודרת.
הערה: כאן, NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP היה נרגש באמצעות לייזר 491 ננומטר עם 50 msec החשיפה זמן עם 20% של לייזר (איור 1i). - מוציאים את המאפה הדמיה ולהוסיף 1 מ"ל של השעיה SRBC ב -7 x 10 6 SRBCs / ml כדי בצלחת (איור 1).
- צנטריפוגה XG ב 500 עבור2 דק 'ב RT לסנכרן phagocytosis, ולהקליט את הזמן בסוף צנטריפוגה זה ולהחזיר את הצלחת על הבמה.
- מטב את GFP המיקוד ללכוד תמונות BF בערימות-Z (לכל העובי של התא, תוך שמירת מרחק-צעד של 0.3 מיקרומטר - בדרך כלל 20 מטוסים) כל דקה במשך שעה 1 לפחות. שמור את זמן לשגות וידאו בקובץ בפורמט יליד מערכת הדמיה בשימוש.
הערה: כאן, סרטים זמן לשגות שנשמרו בתבנית המקורית, * קבצי .stk.
6. ניתוח של זמן לשגות סרטים
- עבור עריכת וידאו, לחץ על התפריט הנפתח 'יישומים' בכרטיסייה "נתונים רב מימדי לבדיקה" תוכנת עריכת וידאו.
- כדי לפתוח את הקובץ, לחץ על "קובץ מאגר בחר" ואז על "בחר Directory". ב "ערכות נתונים", סמן את הרכישה לנתח (בפורמט .nd) ולחץ על "תצוגה". הנתונים מיוצגים בטבלה עם זמן הטורד Z-תוכנית בקו.
- כדי לייצג את הזיהום בהיטל-Z (איור 2, לוחות שמאל), בחר 491 ננומטר אורך גל בתיבת "אורכי הגל" ולחץ על כרטיסיית "הקרנת Z" עם "כל המטוסים".
- כדי לנתח רצף זמן, בחר אורך גל BF בתיבת "אורכי גל" ולבחור את המטוס האופטימלי על ציר ה- Z להבחין SRBCs החיצוני (איור 2, חץ אדום), SRBCs הפנימי (איור 2, עיגול אדום) ואת הגרעין ( איור 2, כחול מעגל).
- כדי לשמור את מצרפי וידאו, לחץ על "בחירה [של X]" כרטיסייה ולאחר מכן על "טען תמונה (ים)". לבסוף, לשמור את התמונות הטעונות .tif בפורמט ולפתוח אותם באים על תוכנת ImageJ.
- השתמש תוסף "מעקב ידני" על התוכנה ImageJ כדי למדוד את המיקום של הגרעין לבין phagosomes התחלואה הנצפים בערוץ BF (איור 3).
- דאוnload התוסף "מעקב ידני" באתר האינטרנט ImageJ. ביום ImageJ, לפתוח את התוסף, רצף התמונה להיות מנותח (איור 3, שלב 1 ו -2).
- הזן את ההגדרות כגון "מרווח זמן" מייצג משך הזמן בין מסגרות סמוכות, ואת "הכיול x / y" אשר מייצג את המרחק לפיקסל (איור 3, שלב 3).
הערה: כאן, להציל את התמונה ברצף עם מרווח זמן של 1 דק 'בין כל מסגרת ו- x / y כיול של 0.205 מיקרומטר משום זום 63X ומצלמה עם פיקסל בגודל של 6.45 x 6.45 מיקרומטר 2 משמשים. - כדי להפעיל את המעקב, לחץ על "הוסף מסלול" (איור 3, שלב 4) ולחץ על מרכז SRBC במועד הראשון כאשר הוא הפנים. הפריים הבא מופיע אוטומטית.
- המשך ללחוץ על מרכז SRBC בכל המסגרות יש עמדות שונות במהלך הזמן (איור 3, שלב 6 ב תיבה אדומה).
- התחל לעקוב אחר לגרעין יש את עמדתה בכל המסגרות ידי לחיצה על במרכזו. בואו לעקוב אחר phagosomes (על ידי לחיצה על במרכזו) אחד אחרי השני בזמן (מסגרת) של ההפנמה שלהם, שונה בתפקוד של SRBCs. לנוחיותכם לראות SRBC בערוץ BF, השתמש "בהירות וחדות" החלון במהלך המעקב (איור 3, שלב 5).
- בין כל מעקב SRBC, לחץ על "הוסף מסלול" (איור 3, שלב 4) יש מסלול חדש. מספר מעקב ישונה בעמודה השנייה, "מסלול n °" של טבלת התוצאות (איור 3, שלב 6).
- שמור את הנתונים בגיליון אלקטרוני כדי להמשיך לשלב הבא של הניתוח.
- השתמש בתוכנת גיליון אלקטרוני כדי לחשב את המרחק של phagosomes המכיל SRBCs כלפי הגרעין לבין המהירות של phagosomes במהלך 5 דקות הראשונות לאחר הפנמת SRBCs (אלחוטיאיור 4).
- פתח את שולחן גיליון אלקטרוני קובץ גיליון אלקטרוני חדש. העבר לתוך קובץ חדש זה הפרמטרים הבאים בלבד, זמן, x ו- y- לתאם של הגרעין וכל SRBCs (איור 4 א).
- כדי לחשב את המרחק בין SRBCs ואת הגרעין עם רק את הקואורדינטות שלהן, לשקול את גרעין וכן SRBC במטוס XY לתאם (איור 4B).
הערה: המרחק בין שתי נקודות הוא אורך הנתיב חיבורם. במטוס, המרחק בין SRBC ואת הגרעין ניתן על ידי משפט פיתגורס.- אם ג (המרחק בין הגרעין לבין SRBC) מציין את אורך האלכסון ו A ו- B מציין את אורכי שתי הצלעות האחרות, לבטא משפט פיתגורס כפי משוואת פיתגורס:
הערה: במקביל, על orthonormal, המרחק האופקיa הוא (גרעין x -x SRBC) ואת b המרחק האנכי הוא (גרעין y -y SRBC). - לפיכך, לחשב את המרחק בין הגרעין לבין SRBC (איור 4 א, מלבן סגול) על ידי:
הערה: להכפיל את ערך המרחק שהושג (בפיקסלים) על ידי x / y כיול כדי לקבל את המרחק ב מיקרומטר. כאן, x / y הכיול הוא 0.205 מיקרומטר. - בכל זמן, להפחית את המרחק בין הגרעין לבין SRBC למרחק הראשוני (איור 4C).
- מגרש את המדידה נגד הזמן עבור 5 הדקות הראשונות. למרוח (איור 5 א) ליניארי מגמה אונליין לעלילה ולקבוע את השיפוע של מגמה אונליין ליניארי המייצג את מהירות phagosome כלפי הגרעין במהלך 5 הדקות הראשונות לאחר הפנמת SRBC.
- איסוף הנתונים לחישוב טעות הממוצעת וסטטיסטית שלהערכים מהירות ואת העלילה אותם בצורה הולמת באמצעות התוכנה המתאימה (איור 5).
- אם ג (המרחק בין הגרעין לבין SRBC) מציין את אורך האלכסון ו A ו- B מציין את אורכי שתי הצלעות האחרות, לבטא משפט פיתגורס כפי משוואת פיתגורס:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FCR בתיווך phagocytosis על ידי HIV-1-נגוע hMDMs הלא נגועים מתואר כאן על ידי שימוש SRBCs IgG-opsonized כמטרות מודל (איור 1). השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם הכנת hMDMs ואת ההדבקה ב- HIV-1. ואכן, התפוקה והאיכות של מקרופאגים בדיל משתנים בין תורמים, כמו גם את שיעור ההדבקה עם יעילות בטווח של 10-40%. בנוסף, הכנת IgG-opsonized-SRBCs חשוב גם כדי למנוע נזק אריתרוציטים, כי זה יכול לגרום הכרתם ספיגת כמו פסולת במקום על ידי phagocytosis בתיווך FCR. opsonization אופטימלית תבטיח phagocytosis יעיל.
תנועת Phagosome לחיות מקרופאגים נגועים ב- HIV מנותח בזמן אמת עם ערוץ BF על מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב במעבדת BSL-3. ההגדרות של ערוץ BF הם לא קריטייםo לראות את הגרעין (איור 2, עיגול כחול) חדות-הבחנה החיצוני (איור 2, ראשי חץ אדום) מן SRBCs הפנימו (איור 2, עיגולים אדומים). מיקרוסקופיה BF נחשבת טכניקת תאורת מיקרוסקופיה אופטית הפשוטה מספיק לראות את phagosomes, שהן פחות refringent מאשר SRBCs החיצוני.
הצעד הראשון לאחר רכישת רצפי תמונה הוא מעקב ידני על תוכנת ImageJ (איור 3). נקודה זו יכולה להיות במיוחד ארוכה ומייגעת, כי עדיף לעקוב אחר כל phagosome, אחד אחד לכל רצפי התמונה והיא נחשבת כי ניסויים צורכים לחזור עם 3 תורם לפחות לכל מצב כדי להגיע לגודל מדגם מספיק גדול עבור ניתוח סטטיסטי (לפחות 30 phagosomes עם 3 תורמים שונים).
הצעד השני הוא הניתוח ב תוכנת גיליון אלקטרוני כדי לחשב את המהירות phagosome במהלך הפנמה 5 דקות לאחר הראשון עבור כל SRBCs הפנימו (איור 4). לשם כך, אנו מתווים לכל phagosome המרחק שעובר במהלך 5 הדקות הראשונות נגד הזמן. דוגמא נציג הוצג hMDMs הלא נגוע על איור 5 א. הבא נקבל את המהירות של phagosome, המהווה את שיפוע עקום רגרסיה ליניארית. מהירות של 0.5384 מיקרומטר / min נמצאה phagosome זה.
מן ראוי לציין כי, אפשר לנתח את מהירות phagosome במהלך הדקות הראשונות לאחר הפנמה, כמתואר כאן או ב Dumas et al. 8, או מאוחר יותר על ידי ניתוח המהירות על לוחות זמנים עוד. במחקר שלנו, צפינו כי מהירות phagosome במהלך 5 הדקות הראשונות לאחר ההפנמה ב hMDMs הנגוע ב- HIV היא נמוכה לעומת hMDMs שאינם נגועים (איור 5).
ילדה = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> 
הכנה איור 1. שליטה hMDMs עם HIV הדמיה phagocytosis. מונוציטים הם מטוהרים על ידי הדבקה (1) הבדיל לתוך מקרופאגים במשך 11 ימים עם M-CSF (2). לאחר מכן, hMDMs נגועים NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP i) בשעה משרד הפנים בין 0.02 ו 0.03 עבור 8 ימים עם כביסה ביום 2 (3). (4) SRBCs-opsonized IgG מתווספים על hMDMs עבור phagocytosis במהלך שעה 1. Phagosomes המכיל SRBCs ניתנים לזיהוי על תמונות BF (עיגול אדום, ii). תמונות ממסד נתוני תמונות servier. בר = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. רכישת בזמן אמת במהלךphagocytosis ידי שליטה יציגים ונוגעים hMDMs עם HIV. hMDMs ערוכים נגוע כמתואר באיור 1. התאים הנגועים NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP מזוהים עם לייזר 491 ננומטר. Z-ערימות של תמונות confocal דיסק מסתובב נרכשות ונותחו באמצעות שתי תוכנת רכישת מיקרוסקופ ImageJ (פנלים משמאל). גלריות של תמונות BF מייצגים (לוחות עליונים מתאימים סרט 1) שאינם נגוע וכן (לוחות תחתונים מתאימים Movie 2) NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP נגוע תא במהלך רכישת 45 דקות (46 תמונות עם זמן מצוין כפי hh : מ"מ). קרום התא (הקו שחור מנוקד), הגרעין (העיגול הכחול), את SRBCs החיצוני (חלקם הצביעו עם ראשי חץ אדומים) ואת SRBCs הפנימי (חלקם הצביעו עם עיגולים אדומים) ניתן לזיהוי על תמונות BF. בר = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
צעדים הוראה איור 3. לניתוח תמונה עם תוסף מעקב ידני על ImageJ. לאחר פתיחת תוסף "מעקב ידני" (1) וטעינה של וידאו זמן לשגות בערוץ BF (2), להזין את הפרמטרים של הרכישה (3). לחץ על "הוסף המסלול" (4) ולהתחיל מדידת מעקב על ידי לחיצה על phagosome אחד (5) להשיג חלון חדש עם עמדות X ו- Y של phagosome שנבחר (6, תיבה אדומה). מי שעוקב אחר phagosome על רצף הזמן לנוחיותכם, לשנות את הבהירות והניגודיות (5 '). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
דמות 4. צעדים הוראה לניתוח נתונים של מהירות הגירה phagosome ב תוכנת גיליון אלקטרוני. (א) הרכיבו את X ו- Y של הגרעין וכל phagosome (תיבה אדומה) בטבלה גיליון אלקטרוני. במאמר נוסף (מלבן סגול), לחשב את המרחק בין phagosome ואת הגרעין עם משפט פיתגורס כאשר c מייצג את האורך בין הגרעין לבין SRBC ו A ו- B אורכי שתי הצלעות האחרות של משולש ישר זווית ( B). (ג) לבסוף, לחשב את המרחק שעובר phagosomes בכל זמן (קופסא ירוקה) על ידי הפחתת המרחק בין SRBC ואת הגרעין בכל זמן נתון מהמרחק הראשוני בשלב 0. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
p_upload / 54,568 / 54568fig5.jpg "/>
איור 5. כימות של מהירות הגירה phagosome בשליטה עם HIV hMDMs. (א) עבור כל SRBC ופשוט לאחר הפנמה SRBC, המרחק כלפי הגרעין נמדדת זממו נגד הזמן. מהירותו במהלך 5 דקות הראשונות מחושבת באמצעות רגרסיה ליניארית תוכנת גיליון אלקטרוני. ניסוי נציג מוצג (להלן SRBC הפנימי של איור 3-4). (ב) כל המהירויות במהלך 5 הדקות הראשונות נמדדות עבור 66 phagosomes ב (תורם 5) שאינם נגועים ו -60 phagosomes בתאים נגועים ב- HIV (4 תורמים). הנתונים מייצגים את ממוצע ± SEM (מבחן Student t מזווג עם תיקון של וולש; **, P <0.01). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
גיל = "1"> 
סרט 1: תנועת Phagosome ב מקרופאג הלא נגוע נציג. . (קליק ימני להוריד) התנועה של תאי דם אדומים opsonized זוהתה ערוץ BF במהלך 45 דקות של phagocytosis עם תמונה אחת לדקה (46 תמונות עם זמן המצוין כפי hh: mm). בר = 10 מיקרומטר.
סרט 2: תנועת Phagosome ב מקרופאג החיים עם HIV נציג. (קליק ימני להוריד). HIV-1 (NLR4.3 HIV-1 Gag iGFP) -infected מקרופאגים זוהו אחרי ההארה עם לייזר 491. התנועה של תאי דם אדומים opsonized זוהתה ערוץ BF במהלך 45דקות של phagocytosis עם תמונה אחת לדקה (46 תמונות עם הזמן המצוין כפי hh: mm). בר = 10 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש טכניקה זו יש כמה שלבים קריטיים. ראשית, הכנת hMDMs והזיהום שלהם על ידי HIV-1 הוא קריטי מאחר ואחוז הזיהום הוא תורם תלוי. ראוי לציין, החלטנו להשתמש מקרופאגים שאינם מקוטבים במבחנה לפני ההדבקה, כי מעמדה של מקרופאגים נתקלו באופן פוטנציאלי על ידי הנגיף in vivo לא התאפיינה טוב עד כה. בדקנו את הביטוי של סמנים משטח מספר, המציין כי מקרופאגים אינם M1 ולא M2, ואישר את הביטוי של CD4 ו CCR5. שיעורי הזיהום הנם משתנה נעים בין 10 ל -40%, ולפעמים נמוכים יותר. שיעור ההדבקה משתנה זו הסיבה מדוע זה יכול להיות קשה למצוא hMDM פלורסנט נגוע ב- HIV-1 מתחת למיקרוסקופ. בנוסף, את הזמן הדרוש כדי למצוא תא נגוע ב- HIV-1 מייד לאחר שלב צנטריפוגה גם יכול להוביל לעיכוב תחילת הרכישה. Phagocytosis יכול להיות יזם ללא synchronization של כריכה, ספיגת שנוצר על ידי צנטריפוגה. עם זאת, אפשרות זו לא נבחרה עבור SRBCs שצף לפני שהגיע התאים. זה יכול להיות אפשרות טובה עם חרוזים. כדי לצמצם את הזמן הדרוש כדי למצוא את התאים הנגועים, מנות תחתית זכוכית gridded יכול לשמש כדי לזהות HIV-1 hMDMs נגוע לפני שתמשיך להפעיל את assay phagocytosis. התאים שנבחרו נשאי HIV, כי יש מספר "סביר" של SRBCs סביבם אז ייבחרו במהירות להתחיל הרכישות. "כמות SRBC סבירה" אומרת מספיק כדי לקבל לפחות 10 SRBCs לכל תא ולא יותר מדי כדי למנוע את SRBCs החיצוני מסווה את phagosomes.
בנוסף, חשוב כדי לייעל את תנאי opsonization כדי להבטיח שלא תהיה הכרה ספיגה יעילות על ידי התאים. Phagocytosis בתיווך FCR הוא המכונן hMDMs הם שגרתי מאוד יעיל ספיגת בתיווך FCR. בנוסף, עבור phagocytosis נכונה, התנאים צריכים bדואר אופטימלי עם תא חימום על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. זה הכרחי כדי לבדוק את הגז והטמפרטורה לפני תחילת assay phagocytosis.
לבסוף אפלית SRBCs החיצוני phagosomes הפנימי זיהוי של הגרעין בערוץ BF חשוב לניתוח על תוכנת ImageJ. זו הסיבה מדוע את ההגדרות של ערוץ זה חשוב. בהתחשב בכך יכול ללכת לאיבוד המוקד במהלך רכישה, אנו ממליצים לרכוש ערימות של תמונות ציר Z כדי להיות בטוח יש מטוס האופטימלי לנתח מהירות phagosome. עדיף יש תא אחד בודד בתחום אחד כדי לנתח את כל SRBCs הפנים עבור כל תא. לכן בחירת העדשה חשובה וכאן השתמשנו 2 עדשות כפונקציה של גודל התא. זה היה יותר קל לנו לעקוב אחר phagosomes עם עדשה 100X, אבל לפעמים התאים היו גדולים מדי אז היינו צריכים לעבור עדשה 63X. הבחירה של עדשה היא גם קריטית כאשר חושבים על imניתוח גיל באמצעות ImageJ ושולחן גיליון אלקטרוני כי העדשות הן לסבך כיולי x / y שונים.
המגבלה הראשונה של טכניקה זו היא כמות הדגימות שצריכים וטרם הספיקה להשיג תוצאות מובהקות סטטיסטית. אנחנו יכולים לרשום כמה סרטים לכל תורם אבל בדרך כלל לא יותר מ -2 תאים לכל מצב, לכל צלחת. הפתרונות כדי שהגבלה זו להגדיל את מספר הדגימות הן לשחזר ניסויים עם תורמים יותר או לעשות הדמיה XY ריבוי נקודות תלוי מיקרוסקופ. אי הנוחות של השיטה האחרונה היא האובדן הפוטנציאלי של מוקד במהלך סריקת XYZ ממונעת. מגבלה נוספת היא כי כימות הידנית של מהירות היא ארוכה ומייגעת לעומת ניתוח אוטומטי. עבור ניתוח מלא אוטומטי, יש צורך להשתמש חלקיקי שכותרתו fluorescently, כפי שדווח במחקרים חלוצית 4 עם חרוזי לטקס מצמידים את הג'לטין עור דגים שהיו אחריו עם אלגוריתם מעקב על תוכנת Matlab. Fluorescently שכותרתו opsonizing נוגדנים או חרוזים יכולים להוות אלטרנטיבה, אבל הם כפופים לבנים, אשר מהווה בעיה בעת הקלטת phagocytosis עבור שעה 1. מחקרים אחרים דיווחו על שימוש של חרוזים לטקס 13,14. שמנו לב, עם זאת, הפנמה של חרוזים לטקס מזוהה פחות בקלות מאשר ספיגת של SRBCs. אכן נקודת המוצא של קינטיקה של הגירה תאית חשובה לדעת לזהות פגמים מוקדם בתנועת phagosomal.
היתרון העיקרי של השיטה המתוארת כאן הוא הפשטות שלו ואת השימוש בתוכנה חופשית. כדי לבצע את המעקב הידני באמצעות תוכנת ImageJ, אנחנו צריכים להשתמש עמדת phagosome ואת הגרעין, וכך, אנחנו צריכים להשתמש משפט פיתגורס כדי לחשב את המרחק בין phagosome ואת הגרעין, וכדי לקבל את המהירות אחרי רגרסיה ליניארית ב תוכנת גיליון אלקטרוני. ניתוח 3 שלבים זה יכול להיות מופחת לכדי שלב אחד בלבד, המעקב, על תוכנה קפוא עם & #34;. מעקב ידני "תוסף נתוני התפוקה הם אז ישירות את המהירות של החלקיקים לעקוב, ועוד במיוחד המהירות היחסית בין 2 קבוצות (כגון phagosomes וגרעין) לבסוף, החישוב מאפשרת לנו למדוד את המהירות היחסית של. אחד חלקיקים לעומת חלקיק אחר כי גם יכול להיות נעים.
היישום העתידי האפשרי של ניתוח הזמן לשגות חיים זה יכול להיות עבור חלקיקים גלויים שדה בהיר, כמו חיידקים, פטריות, או פסולת תא. טיפולים שונים או בתנאי זיהום מספיקים לשינוי התבגרות phagosomal ואת מאפייני ההפעלה של מקרופאגים ירוויח כזה ניתוחים מדויקים של תנועת phagosomal לכיוון מרכז התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | For viral production |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | For acquisition |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Thermo Fischer Scientific | Corning. Inc. 353934 | For human monocyte-derived macrophages |
| Ficoll-Plaque PLUS | Dominique Dutscher | 17-1440-03 | a neutral, highly branched, high-mass, hydrophilic polysaccharide in solution for density centrifugation |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | RT |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, liquid (High Glucose) | GIBCO, Molecular probes | 31966-021 | Conserved at 4 °C ; for HEK cells culture |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | Conserved at 4 °C; for hMDMs culture |
| Fœtal Calf Serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF0001 | Conserved at -20 °C ; decomplemented |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | Conserved at -20 °C ; for hMDMs culture |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use ; for phagocytosis assay |
| FuGENE6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Conserved at 4 °C ; for viral production |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | Conserved at 4 °C |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | Conserved at -20 °C |
| Inverted microscope DMI600 | Leica | ||
| Confocal Spinning Disk Unit CSU-X1M1 | Yokogawa | ||
| 491 nm 50 mW laser | COBOLT CALYPSO | ||
| HCX PL APO CS Objectif | Leica | Objective lens ; Magnification 100X ; Numerical aperture 1.40 ; Immersion oil | |
| CoolSnap HQ2 (FireWire) Camera | Photometrics | Pixel size 6.45 µm x 6.45 µm ; Definition 1,392 x 1,040 ; Encoding the image in 14 Bit | |
| Metamorph 7.7.5 software | Molecular Devices | For the control of the microscope | |
| GraphPad Prism software | For the statistics analysis |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
- Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J. C., Hyman, A. A., Severin, F. F. A role for microtubule dynamics in phagosome movement. J Cell Sci. 111 (Pt 3), 303-312 (1998).
- Blocker, A., et al. Molecular requirements for bi-directional movement of phagosomes along microtubules. J Cell Biol. 137, 113-129 (1997).
- Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
- Feasey, N. A., Dougan, G., Kingsley, R. A., Heyderman, R. S., Gordon, M. A. Invasive non-typhoidal salmonella disease: an emerging and neglected tropical disease in Africa. Lancet. 379, 2489-2499 (2012).
- Mazzolini, J., et al. Inhibition of phagocytosis in HIV-1-infected macrophages relies on Nef-dependent alteration of focal delivery of recycling compartments. Blood. 115, 4226-4236 (2010).
- Dumas, A., et al. The HIV-1 protein Vpr impairs phagosome maturation by controlling microtubule-dependent trafficking. J Cell Biol. 211, 359-372 (2015).
- Greenberg, S., el Khoury, J., Kaplan, E., Silverstein, S. C. A fluorescence technique to distinguish attached from ingested erythrocytes and zymosan particles in phagocytosing macrophages. J. Immunol. Methods. 139, 115-122 (1991).
- Koppensteiner, H., Banning, C., Schneider, C., Hohenberg, H., Schindler, M. Macrophage internal HIV-1 is protected from neutralizing antibodies. J Virol. 86, 2826-2836 (2012).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. 1087, 207-220 (2014).
- Wei, X., et al. Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy. Antimicrob Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Mol Cell Biol. 23, 6494-6506 (2003).
- Toyohara, A., Inaba, K. Transport of phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J Cell Sci. 94 (Pt 1), 143-153 (1989).
