준비 및<em> 생체</em> 액티비티 기반 프로브의 사용을위한<em> N</em> -acylethanolamine 산 아미 다제
Summary
여기서는 활동 기반 프로브의 제조 및 사용을 설명 (ARN14686, 운데 10 ynyl- N – [(3- S) -2- oxoazetidin -3- 일] 카르 바 메이트)의 검출 및 정량화를 허용 염증성 효소 N -acylethanolamine 산 아미 다 아제의 활성 형태 (NAAA), 모두 생체 외 및 생체있다.
Abstract
활동 기반 단백질 프로파일 (ABPP)는 효소의 활성 부위를 타겟팅하는 화학 프로브의 사용을 통해 복잡한 프로테옴 관심 효소의 동정하는 방법이다. 프로브에 도입 된 리포터 태그의 겔 형광 검사, 단백질 오, 형광 현미경, 액체 크로마토 그래피 질량 분석에 의해 효소 표지의 검출을 허용한다. 여기, 우리는 준비 및 복합 ARN14686의 사용, 선택적으로 효소 N -acylethanolamine 산 아미 다제 (NAAA)를 인식하는 클릭 화학의 활동 기반 프로브 (CC-ABP)을 설명합니다. NAAA는 팔미 토일 (PEA)과 oleoylethanolamide (OEA)과 같은 내인성 페 록시 솜 증식 제 – 활성화 수용체 (PPAR) – 알파 작용제를 비활성화하여 염증을 촉진 시스테인 가수 분해 효소이다. NAAA은 리소좀의 산성 pH에서 autoproteolysis에 의해 활성화되는 비활성 전체 길이 proenzyme으로 합성된다. 현지화 연구 시간NAAA은 주로 B 림프구뿐만 아니라, 대 식세포 및 다른 단핵구 유래 된 세포에서 발현되는 것으로 나타 집결지. 우리는 ARN14686 감지하고 단백질 얼룩과 형광 현미경으로 설치류 조직에서 활동 NAAA 생체을 정량화 할 수있는 방법의 예를 제공합니다.
Introduction
일반적 산탄 분석 1,2- 효모 용 액체 크로마토 그래피 질량 분석 플랫폼을 포함하는 발현 패턴의 상호 작용 및 기능 단백질을 조사하는 방법을 사용하는 두 개의 하이브리드 방법 3,4 및 시험 관내 분석에서 그들이 것을 한정 그 나라의 상태에서 단백질의 활성을 평가할 수 없습니다. 활동 기반 단백질 프로파일 (ABPP)이 갭을 채우기 위해 사용될 수있다. 이 방식에서, 작은 분자에 공유 표적 탐지 가능 리포터 그룹에 결합되는 관심있는 효소의 활성 부위에 결합 할 수있는 프로브. 클릭 화학 (CC)를 사용하여 리포터 프로브에 통합 될 수 있거나 또는 표적 결합이 5,6 발생한 후에 도입 될 수있다. 후자의 방법은 SUC 바이오 직교 반응을 통해 리포터 시약 다수 개질 될 수있는 단자 알킨 또는 아 지드와 같은 적합한 화학 그룹을 포함하는 프로브를 사용해야구리 (I)와 같은 시간 [3 + 2] 사이클로 7-9 또는 슈타 우 딩거 결찰 10, 11 Huisgen을 촉매 반응.
최근에는 체외위한 제 ABP와 같은 시스테인 가수 분해 효소, NAAA (12)의 생체 검출의 화합물 ARN14686 개시된. NAAA는 항 염증 핵 수용체 PPAR 알파 13 ~ 15의 내인성 작용제이다 oleoylethanolamide (OEA) 및 팔미 토일 (PEA)을 포함하여 포화 및 불포화 FAES,의 가수 분해 비활성화를 촉매한다. NAAA 주로 선천성 면역 반응의 조절에 중요한 역할을 시사뿐만 B 림프구 (14,16)와 같이, 대 식세포 및 다른 단핵구 유래 된 세포에서 발현된다. 효소는 비활성 형태로 거친 소포체에서 합성 및 autoproteolytic기구 (17)에 의해 세포의 산성 구획에 활성화됩니다. autoproteolytic 분열은 (C13를 새 N 말단 시스테인을 생성마우스 및 쥐에서 1, 인간의 C126), 즉 FAE의 친핵체 책임은 (18, 19)을 가수 분해한다. NAAA 활동의 약리 억제는 FAES 16,20,21 증가 세포 수준에 찬성 FAE 합성 / 분해의 균형을 변경합니다. 여러 β-락톤 및 β – 락탐 유도체는 높은 효능 및 선택성 16,22-26와 NAAA 활성을 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 억제제는 촉매 시스테인 16,27,28의 S의 -acylation을 통해 작용한다.
(- [(S) -2- oxoazetidin -3- 일] 카르 바 메이트 4- cyclohexylbutyl- N) 16 화합물 ARN14686은 전신적 활성 세린 유래 β 락탐 NAAA 억제제의 화학 구조, ARN726에 기초하여 설계되었다. ARN726의 4 부틸 사이클로 헥실 그룹은 아 지드 베어링 기자 태그 이후 CC의 접합을위한 터미널 알킨 태그를 베어링 C9 포화 지방족 체인으로 대체되었다. 우리 minimall하는 두 단계 ABP 디자인을 선택따라서 Y NAAA 용 프로브의 친화력을 유지하면서 원래의 지지체의 구조를 변화. 또한, 부피가 태그의 도입을 피하는 등의 프로브가 직접 ABP보다 생체 내 치료에 적합 할 수있다. ARN14686 높은 효능으로 NAAA 억제 효소 촉매 (12)의 시스테인과 공유 부가 물을 형성함으로써 (hNAAA IC 50 = 6 nM의, rNAAA IC 50 = 13 ㎚). 살아있는 쥐의 실험 프로브가 NAAA가 폐에 표현 캡처 선택적 있음을 보여 주었다. 높은 프로브 농도 (시험 관내에서 10 μM, 10 밀리그램 / 정맥 주사, 정맥 ㎖) (12)를 사용할 때 산성 세라 미다, NAAA와 33~34% ID를 공유하는 다른 시스테인 아미 다제는 또한 낮은 친 화성 대상으로 확인되었다. 우리는 또한 완전한 프로 인트 보조제 (CFA) (29)의 투여 후 염증이 쥐의 조직에서 활동 NAAA의 존재를 연구하는 ARN14686을 사용했다.
여기에서는 preparati위한 프로토콜 개요ARN14686 (그림 1)과 NAAA 활성화 생체의 조사에의 응용의에. 예를 들어, 우리는 CFA 투여 후 쥐의 발에 NAAA을 시각화하는 실험 절차를 설명합니다. 이 실험에서, 단백질은 프로브의 IV 주입 후 발 조직으로부터 추출되고, ABP 표지 프로테옴 비오틴 지드와 CC 받는다. 비오틴 샘플을 스트렙 타비 딘 비드를 사용하여 농축하고, 단백질 블롯 행한다. 다른 응용 프로그램에서, 우리는 프로브 처리 된 마우스에서 마우스의 폐에서 형광 현미경으로 활성화 NAAA의 현지화를 설명합니다. 이 경우, 조직을 절단하고, 절편을 로다 민 첨가 CC 실시된다. 워크 플로 방식은도 2에 도시되어있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
효소 활성은 미세 RNA 전사, 단백질 합성, 단백질 전좌, 번역 후 변형 및 단백질 – 단백질 상호 작용을 포함하여 다양한 수준에서 조절된다. 종종, 효소의 발현 혼자의 활동을 설명하지 않습니다. ABPP는 천연 상태의 단백질의 활성을 연구하기 위해 개발되었다. 두 가지 기능이 요구된다 : 공유 관심 효소 리포터 태그의 활성 부위에 결합하는 화학 프로브는 프로브 – 표지 효소를 검출.
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Nikon Imaging Center at Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, Italy (NIC@IIT).
Materials
| 1,1’-sulfonyldiimidazole | Sigma Aldrich | 367818 | Harmful |
| 2-dipyridylcarbonate | Fluorochem | 11331 | Harmful |
| 2-Methylbutan | Sigma Aldrich | M32631 | Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment |
| 4-(Dimethylamino)pyridine | Sigma Aldrich | 107700 | Toxic |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | Flammable, Corrosive |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | Flammable, Toxic |
| Activated charcoal | Sigma Aldrich | 161551 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | Harmful |
| Azide-PEG3-Biotin | Jena Biosciences | CLK-AZ104P4 | |
| Azide-PEG3-Fluor 545 | Jena Biosciences | CLK-AZ109 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Bio-spin columns | Biorad | 732-6204 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Blocking buffer | Li-Cor Biosciences | 927-40000 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | Higly toxic |
| Bovin serum albumine (BSA) | Sigma Aldrich | A7030 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | B0126 | |
| Bruker Avance III 400 | Bruker | ||
| Celite | Sigma Aldrich | 419931 | Health hazard |
| Ceric ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 22249 | Oxidizing, Harmful |
| Chloral hydrate | Sigma Aldrich | C8383 | Higly toxic |
| CuSO4.5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Toxic |
| Cyclohexadiene | Sigma Aldrich | 125415 | Flammable, Health hazard |
| Cyclohexane | Sigma Aldrich | 34855 | Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 34856 | Harmful, Health hazard |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | Flammable, Harmful |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Acros Organics | 348441000 | |
| Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) | Sigma Aldrich | 175943 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | Flammable, Harmful |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 34858 | Flammable, Harmful |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Irdye 680-LT Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-68031 | |
| IRDye680-LT Streptavidin | Licor | 925-68031 | Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34966 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Flammable, Toxic, Health hazard |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E7750 | Harmful, Corrosive |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | Flammable, Corrosive, Toxic |
| N,N-dimethylformamide | Sigma Aldrich | 227056 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| N-Cbz-L-Serine | Fluorochem | M03053 | Harmful |
| Nikon A1 confocal microscopy | Nikon | Read the user manual | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | |
| Palladium on carbon | Sigma Aldrich | 330108 | |
| p-anisidine | Sigma Aldrich | A88255 | Toxic, Health hazard, Environmental hazard |
| Paraformaldehyde | sigma Aldrich | 441244 | Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | P3265 | |
| ProLong Gold antifade mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | Avoid bubbles formation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Toxic, corrosive, falmmable |
| Sodium hydride | Sigma Aldrich | 452912 | Flammable |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | |
| Starion FLA-9000 immage scanner | FUJIFILM | Read the user manual | |
| Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20349 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Tert-butanol | Sigma Aldrich | 360538 | Toxic, flammable |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 186562 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| Thiourea | Acros Organics | 424542500 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
| Tris | Sigma Aldrich | RDD008 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| Triton-x100 | Sigma Aldrich | X100 | Toxic |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer | IKA | ||
| Undec-10-yn-1-ol | Fluorochem | 13739 | Harmful |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
References
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