Preparazione e<em> In Vivo</em> L'utilizzo di una sonda Activity-based per<em> N</em> -acylethanolamine Acid amidasi
Summary
Qui, descriviamo la preparazione e l'uso di una sonda per attività (ARN14686, undec-10-ynyl- N – [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbammato) che consente la rilevazione e quantificazione del forma attiva dell'enzima proinfiammatorie N amidasica acido -acylethanolamine (NAAA), sia in vitro ed ex vivo.
Abstract
profiling proteine Activity-based (ABPP) è un metodo per l'identificazione di un enzima di interesse in un proteoma complessa attraverso l'uso di una sonda chimica che bersaglia siti attivi dell'enzima. Un tag giornalista introdotto nella sonda permette di rilevare dell'enzima etichettati da in-gel fluorescenza scansione, proteine blot, microscopia a fluorescenza o spettrometria cromatografia-massa liquida. Qui, descriviamo la preparazione e l'uso del ARN14686 composto, una sonda a base di attività di clic chimica (CC-ABP) che riconosce selettivamente l'enzima N amidasi acido -acylethanolamine (NAAA). NAAA è una idrolasi cisteina che promuove l'infiammazione disattivando endogeni agonisti del recettore-alfa proliferazione dei perossisomi attivato (PPAR), come palmitoiletanolamide (PEA) e oleoylethanolamide (OEA). NAAA viene sintetizzato come full-length inattiva proenzyme, che viene attivato dal autoproteolysis nel pH acido del lisosoma. studi di localizzazione have dimostrato che NAAA è prevalentemente espressa in macrofagi e altre cellule derivate da monociti, nonché in B-linfociti. Forniamo esempi di come ARN14686 può essere utilizzato per rilevare e quantificare NAAA attiva ex vivo nei tessuti di roditori da proteine macchia e microscopia a fluorescenza.
Introduction
Comunemente utilizzati metodi per indagare i pattern di espressione, le interazioni e le funzioni delle proteine, comprese le piattaforme di spettrometria di cromatografia-massa liquida per l'analisi fucile 1,2, lievito metodi doppio ibrido 3,4, e in vitro, sono limitati nel senso che sono in grado di valutare l'attività delle proteine nel loro stato nativo. Attività a base di proteine profiling (ABPP) può essere utilizzato per colmare questa lacuna. In questo approccio, piccola molecola sonde in grado di legare covalentemente al sito attivo di un enzima di interesse vengono coniugati ad un gruppo giornalista che consente il rilevamento di destinazione. Utilizzando click chemistry (CC), il giornalista può essere integrato nella sonda o può essere introdotto dopo l'impegno di destinazione si è verificato 5,6. Quest'ultimo metodo richiede l'impiego di sonde contenenti opportuni gruppi chimici, ad esempio un alchino terminale o azide, che può essere modificato con una serie di reagenti giornalista tramite reazioni bio-ortogonali such come Cu (I) -catalyzed Huisgen [3 + 2] cicloaddizione 7-9 o Staudinger legatura 10,11.
Recentemente, abbiamo divulgato la ARN14686 composti come il primo SOA per la in vitro e in vivo di rilevamento della idrolasi cisteina, NAAA 12. NAAA catalizza la disattivazione idrolitica di FAE saturi e monoinsaturi, tra cui oleoylethanolamide (OEA) e palmitoiletanolamide (PEA), che sono agonisti endogeni del movimento anti-infiammatorio dei recettori nucleari PPAR-alfa 13-15. NAAA è prevalentemente espressa in macrofagi e altre cellule derivate da monociti, nonché in linfociti B 14,16, suggerendo un ruolo nella regolazione della risposta immunitaria innata. L'enzima viene sintetizzato nel reticolo endoplasmatico rugoso in forma inattiva e viene attivata in compartimenti acidi della cellula da un meccanismo autoproteolytic 17. La scissione autoproteolytic genera un nuovo cisteina -Terminal N (C131 in topi e ratti, C126 nell'uomo), che è il nucleofilo responsabile FAE Idrolisi 18,19. L'inibizione farmacologica dell'attività NAAA altera l'equilibrio di sintesi / degradazione FAE a favore di un aumento dei livelli cellulari di FAE 16,20,21. Numerosi derivati β-lattone e β-lattamici hanno dimostrato di inibire l'attività NAAA con elevata potenza e selettività 16,22-26. Questi inibitori agiscono attraverso S -acylation della cisteina catalitica 16,27,28.
Il ARN14686 composto è stato progettato sulla base della struttura chimica del, inibitore β-lattamici NAAA serina-derivato sistemicamente attivo, ARN726 (4-cyclohexylbutyl- N – [(S) -2-oxoazetidin-3-il] carbammato) 16. Il gruppo 4-butil-cicloesil di ARN726 è stato sostituito con una catena alifatica C9 saturo recanti un tag alchino terminale per la successiva coniugazione CC con un tag giornalista azide-cuscinetto. Abbiamo scelto di progettare un ABP in due fasi per minimally alterano la struttura del ponteggio originale, mantenendo così l'affinità della sonda per NAAA. Inoltre, evitando l'introduzione di tag ingombranti, tale sonda potrebbe essere più adatto per il trattamento in vivo di un ABP diretta. ARN14686 inibisce NAAA con potenza elevata (hNAAA IC 50 = 6 nM, rNAAA IC 50 = 13 nM) formando un addotto covalente con la cisteina catalitica dell'enzima 12. Gli esperimenti in topi vivi hanno mostrato che la sonda è selettiva nel catturare NAAA espresso nei polmoni. Acido ceramidasi, un'altra amidasi cisteina che condivide 33-34% di identità con NAAA, è stato anche identificato come un obiettivo a bassa affinità utilizzando alte concentrazioni di sonda (10 micron in vitro, 10 mg / ml per via endovenosa, iv) 12. Abbiamo usato anche ARN14686 per studiare la presenza di NAAA attivo nei tessuti infiammati di ratto in seguito a somministrazione di adiuvante completo di Freund (CFA) 29.
Qui, descriviamo un protocollo per i il preparatisu di ARN14686 (Figura 1) e la sua applicazione alla ricerca di NAAA attivazione ex vivo. A titolo di esempio, si descrive una procedura sperimentale di visualizzare NAAA in zampe di ratto dopo la somministrazione CFA. In questo esperimento, le proteine sono estratte dal tessuto zampa dopo l'iniezione iv della sonda, e proteoma ABP-marcato è sottoposto a cc con biotina-azide. campioni Biotinylated sono arricchiti con perline streptavidina, e vengono eseguite le macchie di proteine. In un'altra applicazione, descriviamo la localizzazione di NAAA attiva al microscopio a fluorescenza nei polmoni del mouse da topi trattati con sonda. In questo caso, il tessuto viene sezionata e sezioni sono sottoposti a CC in aggiunta rodamina. Uno schema di flusso di lavoro è illustrato nella figura 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'attività enzimatica è finemente regolata a diversi livelli, tra cui l'RNA di trascrizione, la sintesi proteica, traslocazione di proteine, modificazione post-traslazionale, e l'interazione proteina-proteina. Spesso, l'espressione dell'enzima da solo non tiene conto per la sua attività. ABPP stato sviluppato per studiare l'attività delle proteine nel loro stato nativo. Sono necessarie due funzioni: una sonda chimica che si lega covalentemente al sito attivo di un enzima di interesse e …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Nikon Imaging Center at Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, Italy (NIC@IIT).
Materials
| 1,1’-sulfonyldiimidazole | Sigma Aldrich | 367818 | Harmful |
| 2-dipyridylcarbonate | Fluorochem | 11331 | Harmful |
| 2-Methylbutan | Sigma Aldrich | M32631 | Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment |
| 4-(Dimethylamino)pyridine | Sigma Aldrich | 107700 | Toxic |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | Flammable, Corrosive |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | Flammable, Toxic |
| Activated charcoal | Sigma Aldrich | 161551 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | Harmful |
| Azide-PEG3-Biotin | Jena Biosciences | CLK-AZ104P4 | |
| Azide-PEG3-Fluor 545 | Jena Biosciences | CLK-AZ109 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Bio-spin columns | Biorad | 732-6204 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Blocking buffer | Li-Cor Biosciences | 927-40000 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | Higly toxic |
| Bovin serum albumine (BSA) | Sigma Aldrich | A7030 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | B0126 | |
| Bruker Avance III 400 | Bruker | ||
| Celite | Sigma Aldrich | 419931 | Health hazard |
| Ceric ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 22249 | Oxidizing, Harmful |
| Chloral hydrate | Sigma Aldrich | C8383 | Higly toxic |
| CuSO4.5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Toxic |
| Cyclohexadiene | Sigma Aldrich | 125415 | Flammable, Health hazard |
| Cyclohexane | Sigma Aldrich | 34855 | Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 34856 | Harmful, Health hazard |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | Flammable, Harmful |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Acros Organics | 348441000 | |
| Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) | Sigma Aldrich | 175943 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | Flammable, Harmful |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 34858 | Flammable, Harmful |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Irdye 680-LT Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-68031 | |
| IRDye680-LT Streptavidin | Licor | 925-68031 | Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34966 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Flammable, Toxic, Health hazard |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E7750 | Harmful, Corrosive |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | Flammable, Corrosive, Toxic |
| N,N-dimethylformamide | Sigma Aldrich | 227056 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| N-Cbz-L-Serine | Fluorochem | M03053 | Harmful |
| Nikon A1 confocal microscopy | Nikon | Read the user manual | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | |
| Palladium on carbon | Sigma Aldrich | 330108 | |
| p-anisidine | Sigma Aldrich | A88255 | Toxic, Health hazard, Environmental hazard |
| Paraformaldehyde | sigma Aldrich | 441244 | Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | P3265 | |
| ProLong Gold antifade mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | Avoid bubbles formation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Toxic, corrosive, falmmable |
| Sodium hydride | Sigma Aldrich | 452912 | Flammable |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | |
| Starion FLA-9000 immage scanner | FUJIFILM | Read the user manual | |
| Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20349 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Tert-butanol | Sigma Aldrich | 360538 | Toxic, flammable |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 186562 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| Thiourea | Acros Organics | 424542500 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
| Tris | Sigma Aldrich | RDD008 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| Triton-x100 | Sigma Aldrich | X100 | Toxic |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer | IKA | ||
| Undec-10-yn-1-ol | Fluorochem | 13739 | Harmful |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
References
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