Un método para medir el ARN<em> N</em⁶ -methyladenosine Modificaciones en células y tejidos

Summary

Se describe un método de transferencia de Northern modificado para la medición de N ⁶ -methyladenosine (m ⁶ A) las modificaciones en el ARN. El método actual puede detectar modificaciones en diversos ARN y controles en virtud de diversos diseños experimentales.

Abstract

N⁶-Methyladenosine (m⁶A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m⁶A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m⁶A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m⁶A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m⁶A modifications in various sources of RNA. While m⁶A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m⁶A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

Introduction

Dynamic and reversible RNA modifications have important roles in RNA homeostasis. Four decades ago, N⁶-methyladenosine (m⁶A) modifications were found to be abundant in eukaryotic transcriptomes¹. They have diverse functions in messenger RNA (mRNA), ribosomal RNA (rRNA), small nucleolar RNA, transfer RNA, and microRNA². The m⁶A modifications of mRNA influence their splicing³, translation⁴, degradation⁵, and localization². Moreover, they affect ribosome biogenesis and microRNA function⁶. The evolutionary conservation of m⁶A modifications of RNA is noted in unicellular bacteria to multi-cellular humans⁷. Delineation of the roles of m⁶A modifications is currently under extensive exploration. The efforts are expected to provide new insights into transcription control. Recent studies reveal that other chemical modifications of mRNA⁸ also play critical roles in RNA metabolism.

Circadian rhythms⁹, stem cell pluripotency¹⁰, triglyceride metabolism⁴, fibrosis¹¹, obesity¹², and major depression¹³ are a few examples of processes where m⁶A modifications are known to control outcomes. Many circadian clock gene transcripts have m⁶A sites¹⁴. Modulation of m⁶A methylase or demethylase elicits circadian period changes¹⁵. Mettl3, an m⁶A transferase, is a regulator for stem cell pluripotency. A deficiency of Mettl3 leads to early embryonic lethality and aberrant lineage priming at the post-implantation stage¹⁰. A deficiency of fat mass- and obesity-associated (FTO), an m⁶A demethylase, in adipocytes affects fatty acid mobilization and body weight through posttranscriptional regulation of Angptl4⁴. These studies reveal that m⁶A not only controls mRNA processing, but also plays critical roles in embryological development and patho-physiology. The function of m⁶A modifications holds implications for therapeutic considerations in the future.

Several methods are available to measure m⁶A modifications of RNA^16-18. Traditionally, thin layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) are used to study the distribution of m⁶A in several RNAs^19,20. Mass spectrometry is a sensitive tool for the detection of m⁶A modifications in RNA. However, the RNA needs to be excised by RNase into short fragments before analysis by mass spectrometry²¹. Methyl-RNA immunoprecipitation and sequencing (m⁶A-Seq)²² immunoprecipitates fragmented RNAs with m⁶A-specific antibodies and performs parallel RNA sequencing. This method generates transcriptome-wide m⁶A landscapes. High-resolution mapping of m⁶A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation (miCLIP) further maps m⁶A modifications at a single-nucleotide resolution²³. Both methods provide details of m⁶A modification across the whole transcriptome, with specific genes’ information. However, quantifications and standardization in both methods are difficult if experiments require the comparison of multiple conditions. Moreover, fragmentations of RNA for m⁶A-Seq alter the original RNA structure, which may affect native m⁶A levels. To detect global m⁶A modifications of RNA and their changes under different experimental conditions, we report a method that employs a modified northern blotting protocol. This method resolves RNA by molecular weight, using gel electrophoresis¹⁸. This procedure provides better standardization and quantifications for experiments that involve multiple conditions or samples. It also provides specific m⁶A modification information for different RNAs, whether rRNA, mRNA, or microRNA.

Protocol

NOTA: El ARN total m 6 A nivel incluye ARNr, ARNm, y otros ARN pequeños. Puesto que el ARN ribosomal tiene abundantes m 6 modificaciones A, la medición de los niveles A 6 m deberán tener en cuenta este hecho. 1. Aislamiento de ARN El uso de la solución de descontaminación ribonucleasa (pulveriza sobre toallas de papel), limpie las pipetas y las superficies de mesa de laboratorio. toallas de papel mojadas con agua libre de nucleasa y limpiar las pipetas y las superficies de mesa de laboratorio de nuevo. La extracción de RNA Aislamiento de ARN total El uso de un agitador de cabeza, homogeneizar 50-100 mg de tejido o de 5-10 x 10 6 células en 1 ml de solución de aislamiento de ARN mantenidas a 4 ° C. NOTA: Más de tejido (100-150 mg) pueden ser necesarios para las muestras de tejido adiposo de ratones debido a las concentraciones de ARN más bajos en el mismo. Las muestras proceden de corazón de ratón, hígado, músculo esquelético, pulmón, cerebro, y los macrófagos se han empleado previamente 4. EnCubate los homogeneizados de muestra durante 5 min a temperatura ambiente. Añadir 100 ml de 1-bromo-3-cloropropano (BCP) por 1 ml de homogeneizado de la muestra. Agitar los tubos vigorosamente durante 15 s y proceder a aislar RNA total de acuerdo con las instrucciones del fabricante 24. Poliadenilado de purificación de ARNm a partir de ARN total aislado Purificar el ARNm poliadenilado utilizando kits o protocolos disponibles. Agitar a fondo para volver a suspender cada una de las siguientes soluciones: solución de enlace, perlas de poliestireno oligo (dT), y solución de lavado de 2x. Asegúrese de que el oligo (dT) Cuentas de calentar a temperatura ambiente antes de su uso. Transferir 120 l de solución de elución por la preparación en un tubo y se calienta a 70 ° C en un bloque de calentamiento. Pipetear hasta 500 g de ARN total en un tubo de microcentrífuga. Con agua libre de nucleasa, ajustar el volumen a 250 mL. Añadir 250 l de solución de enlace 2x con el ARN total, de modolución y vortex brevemente para mezclar el contenido. Añadir 15 l de oligo (dT) perlas y mezclar bien para mezclar. Incubar la mezcla a 70 ° C durante 3 min. Sacar la muestra del bloque de calentamiento y se deja reposar a temperatura ambiente durante 10 min. Se centrifuga a 15.000 xg durante 2 min. Retirar con cuidado el sobrenadante, dejando atrás aproximadamente 50 l. Añadir 500 l de solución de lavado a una nueva suspensión del sedimento con la pipeta. Pipetear la suspensión en un conjunto tubo de filtro giratorio / colección. Se centrifuga a 15.000 xg durante 2 min. Retirar la columna del tubo de recogida y desechar el flujo a través. Retorno de la columna para el tubo de recogida. Pipetear 500 l de solución de lavado sobre el filtro de centrifugado. Centrifugar a 15.000 x g durante 2 min. Transferir el filtro giratorio en un tubo de recogida fresca. Pipetear 50 l de solución de elución calientaa 70 ° C en el centro del filtro de centrifugado. Incubar durante 2-5 minutos a 70 ° C. Se centrifuga a 15.000 xg durante 1 min. Pipetear un 50 l adicionales de solución de elución se calienta a 70 ° C en el centro del filtro de centrifugado. Repita el paso 1.2.2.1.18. Añadir 100 g / ml de glucógeno, 0,1 volumen de tampón de sodio 3 M de acetato (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol absoluto. Precipitar durante la noche a -80 ° C. Centrifugar a 15.000 xg durante 25 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante. Lavar el sedimento con 1 ml de 75% de etanol. Centrifugar a 15.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Retirar con cuidado el etanol. Secar al aire durante 3-5 min. Añadir 10 l de agua libre de nucleasa a disolver el precipitado. Almacenar a -70 ° C. Calificación y Cuantificación de ARN El uso de un espectrofotómetro, determinar la concentración de ARN por NotIng de la absorbancia a 260 nm y 280 nm. La relación A 260 / A 280 debería ser 1/8 a 2/2. Comprobar la calidad de las muestras de ARN mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% 25. NOTA: El ARN total eucariota intacta debería mostrar intensas bandas 28S y 18S rRNA. La relación de 28S frente a la intensidad de banda 18S rRNA para una buena preparación de ARN es ~ 2. 2. Electroforesis en gel y transferencia NOTA: Los protocolos de preparación de tampón se dan en la Tabla 1. El formaldehído Preparación del gel (1%) Enjuague todo el equipo de electroforesis con agua diethylpyrocarbonate (DEPC). Derretir 2,5 g de agarosa en 215 ml de agua DEPC completamente en un horno de microondas. Añadir 12,5 ml de 10x 3- (N- morfolino) propanosulfónico (MOPS) tampón y 22,5 ml de formaldehído al 37%. Se vierte en el aparato de electroforesis con un peine de espesor 1,5 mm. Eliminar las burbujas o empujar tdobladillo a los bordes del gel con un peine limpia. Permitir que el gel solidifique a temperatura ambiente. Preparación de la muestra Mezclar 1-10 g de ARN total y 11,3 l de tampón de muestra. Mezclar 2 g del marcador de ARN (1 g / l) con 11,3 l de tampón de la muestra. Añadir agua libre de nucleasa a las muestras de 2.2.1 y 2.2.2 a un volumen total de 16 mL. Se calienta a 60 ° C durante 5 min, y luego se enfría en hielo. Mezclar 16 l de la muestra a partir de 2.2.3 con 4 l de colorante de seguimiento, que contiene 0,1 g / l de bromuro de etidio en hielo. PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es teratogénico y posiblemente tóxicos si se inhalan. Leer bromuro de etidio hoja técnica de seguridad. electroforesis Añadir 200 ml de 10x MOPS buffer de 1.800 ml de ddH2O para hacer un tampón de desarrollo 1x MOPS. Utilice el tampón de MOPS 1x para enjuagar los pocillos del gel. Previa al funcionamiento de tél gel a 20 V durante 5 min. Cargar las muestras de ARN en los pocillos del gel. Cubrir con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Ejecutar a 35 V durante aproximadamente 17 h (durante la noche) Examinar y fotografiar el gel bajo una luz ultravioleta. Transferir Cortar el gel para eliminar la parte no utilizada. Preparar 500 ml de tampón 10x SSC (250 ml de 20x tampón SSC y 250 ml de agua DEPC). Se lava el gel dos veces con 10x tampón SSC durante 20 min con agitación a 50 rpm. Cortar la hoja de papel 1 de filtro suficientemente grande para servir como un documento de mecha, que absorbe tampón de transferencia de la bandeja de transferencia (Figura 1). Cortar 4 trozos de papel de filtro para el mismo tamaño que el gel. Cortar 1 hoja de membrana de nylon cargada positivamente con el mismo tamaño que el gel. Marque una muesca en el gel y la membrana como un marcador para asegurar la orientación apropiada. Remojar la membrana en tampón SSC 2x durante 15 minutos. Verter 500 ml de Of 10x SSC tampón en la bandeja de transferencia. Ponga la hoja de papel de filtro grande a través de la placa de vidrio y humedecer el papel de filtro con tampón de transferencia. Estirar las burbujas con una pipeta. Remojar 2 piezas de papel de filtro de pre-corte en tampón de transferencia y colocarlos en el centro del papel de filtro de paso 2.4.5. Eliminar las burbujas. Coloque el lado superior del gel en el papel de filtro. Colocar la membrana en la parte superior del gel. Alinear las muescas del gel y la membrana. Colocar 2 piezas de papel de filtro de pre-corte en la parte superior de la membrana y humedecer el papel de filtro con tampón de transferencia. Eliminar las burbujas entre las capas. Aplicar una envoltura de plástico alrededor del gel para asegurar que las toallas solamente absorben tampón que pasa por el gel y la membrana. Pila de las toallas de papel en la parte superior del papel de filtro. Colocar una placa de vidrio de gran tamaño en la parte superior de las toallas. Coloque un peso en la parte superior de la pila. Mantener durante la noche para permitir que el ARN para transferir desde el gel a la membrana. 3. Detección de N 6 -methyladenosine La reticulación de la membrana Mantener la membrana húmeda en tampón SSC 2x. Coloque 2 hojas de papel de filtro sumergido con tampón 10x SSC en agente de reticulación UV. Colocar la membrana en la parte superior del papel de filtro, con el lado de ARN adsorbido hacia arriba. Seleccionar "modo autocrosslink" (120.000 mu J) y pulse el botón "Inicio" para iniciar la irradiación. Examinar la membrana y el gel con una imagen gel receptor UV para confirmar la transferencia del ARN del gel a la membrana. inmunotransferencia Bloquear la membrana en la leche no grasa 5% en solución salina tamponada con Tris con 20 tampón de Tween (TBST) a temperatura ambiente durante 1 hr. Lavar tres veces con tampón de TBST durante 15 min. Incubar la membrana durante la noche en m 6 A (<em> solución de N 6 -methyladenosine) de anticuerpos (1: no grasa de la leche TBST buffer 1.000 en 5%) a 4 ° C. Se lava la membrana tres veces con tampón de TBST durante 15 min. Incubar la membrana en la solución de burro conjugado con HRP anti-anticuerpo de conejo (1: 2000 en tampón TBST leche 5% no grasa) durante 1 h a temperatura ambiente. Se lava la membrana tres veces con tampón de TBST durante 15 min. Aplicar el sustrato quimioluminiscente intensificado (0,125 ml por cm2 de membrana). Capturar la quimioluminiscencia con los ajustes óptimos de la cámara digital, de acuerdo con las instrucciones del fabricante 26. m 6 una cuantificación Medir la m 6 Una intensidad de quimioluminiscencia relativa utilizando el software ImageJ. Bajo el menú del software ImageJ, seleccione la opción "Archivo" para abrir el archivo pertinente. Seleccione la herramienta "Rectángulo" de ImageJ y dibujar un marco alrededorlas señales. Si RNA ribosomal no es el foco de los experimentos, evitar los 18S y 28S ARN ribosomal m 6 bandas A para el cálculo. Haga clic en "Comando" y "1" para confirmar el carril seleccionado. Pulse la tecla "Comando" y "3" para mostrar la parcela seleccionada. Haga clic en la herramienta "Straight" y trazar líneas para separar el área segmentada. Haga clic en la herramienta "varita" para registrar las mediciones. Exportar los datos. Normalizar los niveles de m 6 A con el 18S ARN ribosomal banda de la tinción con bromuro de etidio.

Representative Results

Después de 14 días en la fase circadiana normal de luz-oscuridad, los ratones de tipo salvaje se colocaron en la oscuridad constante. Los ARN de hígado fueron muestreados a intervalos de 4 horas y estudiados con el norte de secante modificada. La metilación de rRNAs, mRNAs, y pequeños RNAs se detectaron claramente (Figura 2). La comparación entre diferentes momentos circadianos (CT) se puede calcular con precisión con el estándar de 18S rRNA. Hubo robusta oscilación circadiana de m 6 niveles A en ARNr, ARNm y ARN pequeños. Para evitar la interferencia ofrecida por ARNr, ARN poliadenilados se pueden purificar, como en el paso 1.2.2. Después de la purificación, el rRNA puede ser eliminado en gran medida para permitir una mejor visualización de los otros ARN (Figura 3). <stron g> Figura 1: Montaje de la unidad de transferencia blot. Se muestra la unidad de transferencia capilar para secar el ARN a la membrana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: El ritmo circadiano de los m 6 niveles A en ratones C57BL / 6J. Esta figura muestra la m 6 Una mancha de ARN total de hígado de los ratones de tipo salvaje se sacrificó en el primer día de la fase oscura-oscura después de 14 días de una fase normal de luz-oscuridad a las 4 h intervalos. La cuantificación se realizó utilizando el m 6 A diferencia de densidad de imagen entre 18S y 28S rRNA. El m 6 Un abundancia se normalizó a la banda de 18S rRNA de la gel de formaldehído en la parte inferior.et = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Los m 6 borrones A con o sin rRNA. M representativos se muestran 6 A borrones de ARN total y ARN poliadenilado de los hígados de los ratones de tipo salvaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 1 10x tampón MOPS (pH 7,0, protegerlo de la luz) MOPS 41.85 gramo 0,2 M Acetato de sodio 4.1 gramo 0,05 M EDTA, sal disódica 3.7 gramo 0,01 M agua DEPC Total 1 L Se agita a temperatura ambiente 2 tampón SSC 20x (pH 7,0) Cloruro de sodio 175.3 gramo 3 M Citrato de trisodio 88.3 gramo 0,3 M agua DEPC Total 1 L </td> Se agita a temperatura ambiente, a continuación, el autoclave 3 colorante guía 10x tampón MOPS 500 l 1x Ficoll 400 0.75 gramo 15% azul de bromofenol 0.01 gramo 0,2% xileno cianol 0.01 gramo 0,2% agua DEPC Total 5 ml Almacenar a -20 ° C 4 agua DEPC Diluir en relación 1: 1.000 de DEPC en ddH2O Se agita durante la noche a temperatura ambiente, a continuación, el autoclave 5 tampón de muestra (protegerlo de la luz) 10x tampón MOPS 200 l 37% de formaldehído 270 l formamida 660 l Almacenar a -20 ° C </tbody> Tabla 1: Los tampones y soluciones.

Discussion

Modifications of RNA have important roles in cellular function and physiology. The current understanding of the regulation, function, and homeostasis of these modifications is still being explored and expanded⁸. Therefore, a precise and gold-standard method to evaluate the modifications of RNA is needed. The modified northern blotting method provides precise quantification of RNA modifications and clear delineation of the modifications in diverse RNAs. Although the method requires at least 3 days, it can be standardized and can be used in various experimental designs. Moreover, with different antibodies, it can detect different RNA modifications²⁷.

It is important to separate different RNAs when analyzing RNA modifications. Ribosomal RNA comprises a large portion of the total amount of RNA^28,29. The results from analyzing RNA modifications only in total RNA will represent mostly the changes of rRNA. Methylation and other such modifications of rRNA could potentially mask the changes in other RNAs. With the procedure of gel separation, the modifications of mRNA and other small RNAs can be more accurately analyzed.

Transcriptome-wide mapping with m⁶A immunoprecipitation and sequencing provides detailed insight into the modification of each type of RNA²². It provides information on the specific RNAs and a resolution of around 80-120 bp. Although m⁶A-Seq can compare the modifications between different experimental conditions, the selection of proper standards and controls for such experiments is difficult¹⁸. Immunoprecipitation is difficult to reproduce, often giving significant variations amongst repeats. Moreover, m⁶A-Seq requires the fragmentation of RNA samples before immunoprecipitation and sequencing³⁰. The fragmentation process could potentially induce undue influences on the original RNA modifications. If the experiment does not need the specific gene’s information but requires different conditions for comparison, the current method provides better visualization and control for diverse experimental setups.

Modification of RNA is an important step in regulating transcriptional control³¹. However, the homeostasis and the regulatory mechanisms of various RNA modifications under diverse physiological realms are still unclear. Using the present modified northern blotting method, different RNA modifications can be quantified and compared. Furthermore, the changes and regulations of RNA modifications can be investigated in greater detail. In the future, it could also be possible to combine the experimental data from both the classical northern blotting and the modified northern blotting protocols, providing greater insights into RNA biology.

The most important factor determining the success of the modified northern blotting protocol is the integrity of the RNA sample. RNAs with some amount of degradation may yield good classical northern blotting results, but this could potentially have significant impact on the modified northern blotting results. The modifications of RNA in different tissues or cell lines could also vary significantly. It is important to test the suitable RNA sample loads for different tissues before performing the final experiments.

As blotting procedures have been traditionally named after Dr. Southern and different geographical directions, we propose the name “northeastern” blotting for the current technique.

Materials

RNaseZap solution	Ambion	AM9782	Protocol 1.1
TRI Reagent solution	Ambion	AM9738	Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP)	Sigma	B9673	Protocol 1.2.1.3
Ethanol	JTbaker	8006	Protocol 1.2.1.3
Isopropanol	Sigma	I9516	Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit	Sigma	MRN70	Protocol 1.2.2.1
Glycogen	Ambion	AM9510	Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate	Fluka	71183	Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water	Ambion	AM9930	Protocol 1.2.2.6
DEPC	Sigma	D5758	Protocol 2.1.1
Agarose	JT Baker	A426	Protocol 2.1.2
MOPS	Sigma	M1254	Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution	Sigma	F8775	Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt	JT Baker	8993	Protocol 2.1.3 10X MOPS buffer
formamide	Sigma	F7503	Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker	Ambion	AM7150	Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide	Amresco	X328	Protocol 2.2.5
Ficoll 400	GE Healthcare	17-0300-10	Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue	Sigma	114391	Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol	Sigma	X4126	Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride	JT Baker	3624	Protocol 2.4.2 20X SSC buffer
Trisodium citrate	Sigma	S1804	Protocol 2.4.2 20X SSC buffer
filter paper	GE Healthcare	RPN6101M	Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane	GE Healthcare	RPN303B	Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400	Stratagene	400075	Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500	ANT Technology	Gel Catcher 1500	Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine)	Synaptic Systems	202003	Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab	GE Healthcare	NA934	Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System	BIO-RAD	1708280	Protocol 3.2.8