RNA ölçülmesi için bir yöntem<em> K</em<sup> 6</supHücre ve dokularda> -methyladenosine Değişiklikler

Summary

RNA N ⁶ -methyladenosine (m ⁶ A) değişiklikleri ölçmek için bir değiştirilmiş Northern lekeleme yöntemi tarif edilmektedir. Geçerli yöntem çeşitli deneysel tasarımlar altında çeşitli RNA'lar modifikasyonlar ve kontrolleri tespit edebilir.

Abstract

N⁶-Methyladenosine (m⁶A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m⁶A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m⁶A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m⁶A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m⁶A modifications in various sources of RNA. While m⁶A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m⁶A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

Introduction

Dynamic and reversible RNA modifications have important roles in RNA homeostasis. Four decades ago, N⁶-methyladenosine (m⁶A) modifications were found to be abundant in eukaryotic transcriptomes¹. They have diverse functions in messenger RNA (mRNA), ribosomal RNA (rRNA), small nucleolar RNA, transfer RNA, and microRNA². The m⁶A modifications of mRNA influence their splicing³, translation⁴, degradation⁵, and localization². Moreover, they affect ribosome biogenesis and microRNA function⁶. The evolutionary conservation of m⁶A modifications of RNA is noted in unicellular bacteria to multi-cellular humans⁷. Delineation of the roles of m⁶A modifications is currently under extensive exploration. The efforts are expected to provide new insights into transcription control. Recent studies reveal that other chemical modifications of mRNA⁸ also play critical roles in RNA metabolism.

Circadian rhythms⁹, stem cell pluripotency¹⁰, triglyceride metabolism⁴, fibrosis¹¹, obesity¹², and major depression¹³ are a few examples of processes where m⁶A modifications are known to control outcomes. Many circadian clock gene transcripts have m⁶A sites¹⁴. Modulation of m⁶A methylase or demethylase elicits circadian period changes¹⁵. Mettl3, an m⁶A transferase, is a regulator for stem cell pluripotency. A deficiency of Mettl3 leads to early embryonic lethality and aberrant lineage priming at the post-implantation stage¹⁰. A deficiency of fat mass- and obesity-associated (FTO), an m⁶A demethylase, in adipocytes affects fatty acid mobilization and body weight through posttranscriptional regulation of Angptl4⁴. These studies reveal that m⁶A not only controls mRNA processing, but also plays critical roles in embryological development and patho-physiology. The function of m⁶A modifications holds implications for therapeutic considerations in the future.

Several methods are available to measure m⁶A modifications of RNA^16-18. Traditionally, thin layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) are used to study the distribution of m⁶A in several RNAs^19,20. Mass spectrometry is a sensitive tool for the detection of m⁶A modifications in RNA. However, the RNA needs to be excised by RNase into short fragments before analysis by mass spectrometry²¹. Methyl-RNA immunoprecipitation and sequencing (m⁶A-Seq)²² immunoprecipitates fragmented RNAs with m⁶A-specific antibodies and performs parallel RNA sequencing. This method generates transcriptome-wide m⁶A landscapes. High-resolution mapping of m⁶A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation (miCLIP) further maps m⁶A modifications at a single-nucleotide resolution²³. Both methods provide details of m⁶A modification across the whole transcriptome, with specific genes’ information. However, quantifications and standardization in both methods are difficult if experiments require the comparison of multiple conditions. Moreover, fragmentations of RNA for m⁶A-Seq alter the original RNA structure, which may affect native m⁶A levels. To detect global m⁶A modifications of RNA and their changes under different experimental conditions, we report a method that employs a modified northern blotting protocol. This method resolves RNA by molecular weight, using gel electrophoresis¹⁸. This procedure provides better standardization and quantifications for experiments that involve multiple conditions or samples. It also provides specific m⁶A modification information for different RNAs, whether rRNA, mRNA, or microRNA.

Protocol

NOT: 6 A level rRNA, mRNA ve diğer küçük RNA'lar dahil toplam RNA m. Ribozomal RNA bol M 6 A değişiklikleri, 6 A seviyesi bu gerçeği dikkate almak gerekir m ölçümünü beri. 1. RNA İzolasyon (Kağıt havlu üzerine püskürtülen) ribonükleaz dekontaminasyon solüsyonu kullanarak, pipet ve laboratuar tezgah yüzeyleri silin. Islak kağıt nükleaz içermeyen su ile havlu ve tekrar pipet ve laboratuvar tezgah yüzeyleri silin. RNA Ekstraksiyonu Toplam RNA İzolasyon Bir kafa üstü karıştırıcı kullanılarak, doku, 50-100 mg ya da 4 ° C 'de muhafaza RNA izolasyon çözeltisi 1 mL 5-10 x 10 6 hücre homojenleştirin. Not: fazla doku (100-150 mg), çünkü burada daha düşük RNA konsantrasyonların farelerden adipoz doku örnekleri için gerekli olabilir. Örnekler fare kalp, karaciğer, iskelet kası, akciğer, beyin kaynaklı ve makrofajlar, daha önce 4 kullanılmıştır. İçindeOda sıcaklığında 5 dakika boyunca numune homojenatları cubate. Örnek homojenat 1 ml başına 1-bromo-3-kloropropan (BCP) 100 mcL ekleyin. 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır tüpleri ve üretici talimatlarına 24'e göre, toplam RNA izole etmek için devam edin. İzole edilmiş toplam RNA'dan poliadenile mRNA Saflaştırma olarak temin edilebilen kitler veya protokoller kullanılarak poliadenile edilmiş mRNA'nın arındırın. Aşağıdaki çözeltinin her yeniden askıya iyice çalkalanır: 2x bağlama çözeltisi, oligo (dT) polistiren boncuklar ve yıkama solüsyonu. oligo (dT) kullanılmadan önce oda sıcaklığına getirin boncuk emin olun. bir ısıtma bloğu içinde 70 ° C'de bir boru ve ısıya hazırlık başına elüsyon çözeltisi 120 uL aktarın. Bir mikrosantrifüj tüpe toplam RNA 500 mg kadar pipetle. nükleaz içermeyen su ile 250 mcL ses seviyesini ayarlamak. toplam RNA 2x bağlayıcı çözeltisi 250 uL ekleyin böylecedökülmesinden ve vorteks kısaca içeriğini karıştırmak için. oligo 15 mcL ekleyin (dT) boncuk ve vorteks iyice karıştırın. 3 dakika boyunca 70 ° C'de inkübe karışımı. Isıtma bloğu numuneyi çıkarın ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilir. 2 dakika için 15,000 x g'de santrifüjleyin. Dikkatle arkasında yaklaşık 50 uL bırakarak süpernatant kaldırmak. pipetleme pelet yeniden askıya yıkama solüsyonu 500 mcL ekleyin. Bir spin filtre / toplama tüpü kümesine süspansiyonu pipetle. 2 dakika için 15,000 x g'de santrifüjleyin. toplama tüpünden sütunu kaldırmak ve flow-through atın. toplama tüpüne sütun dönün. Spin filtre üzerine yıkama solüsyonu Pipet 500 uL. 15.000 x santrifüj 2 dakika boyunca örn. taze toplama tüpüne sıkma filtre aktarın. Elüsyon çözeltisi pipetle 50 uL ısıtıldı70 ° C'ye kadar eğirme filtrenin merkezi üzerine. 70 ° C'de 2-5 dakika boyunca inkübe edin. 1 dakika için 15,000 x g'de santrifüjleyin. Spin filtrenin merkezi üzerine 70 ° C'ye kadar ısıtıldı elüsyon çözeltisi ilave 50 uL pipetle. Tekrarlayın Adım 1.2.2.1.18. 100 ug / mL glikojen, 3 M sodyum asetat tamponu (pH 5.2), ve mutlak etanolün 2.5 hacim 0.1 hacim. -80 ° C de bir gece hızlandırabilir. 4 ° C'de 25 dakika boyunca 15,000 x g'de santrifüjleyin. süpernatant atın. % 75 etanol içindeki 1 ml pelet yıkayın. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 15,000 x g'de santrifüjleyin. Dikkatlice etanol çıkarın. 3-5 dakika boyunca hava içinde kurutulur. pelet çözmek için nükleaz içermeyen su 10 uL ekleyin. -70 ° C'de saklayın. RNA Yeterlilik ve miktarının belirlenmesi Bir spektrofotometre kullanılarak, Notl RNA konsantrasyonunu belirlemek260 nm ve 280 nm 'de absorbans ng. A 260 / A 280 oranı 1.8-2.2 olmalıdır. % 0.8 agaroz jel elektroforezi 25 kullanılarak RNA örnek kalitesini kontrol edin. NOT: sağlam ökaryotik toplam RNA yoğun 28S ve 18S rRNA bantları göstermesi gerekir. İyi bir RNA preparasyonu için 18S rRNA bandı şiddeti ile 28S oranı ~ 2. 2. Jel Elektroforez ve Transferi NOT: Tampon hazırlama protokolleri Tablo 1'de verilmiştir. Formaldehid jel hazırlanması (% 1) diethylpyrocarbonate (DEPC) su ile tüm elektroforez cihazları durulayın. Tamamen bir mikrodalga fırınında DEPC su 215 mL agaroz 2.5 g eritin. 10x 3- (N-morfolino) propansülfonik asit (MOPS), 12.5 ml tampon ve% 37 formaldehid 22.5 ml. 1.5 mm kalınlığında tarak ile elektroforez cihazının içine dökün. t kabarcıkları ortadan kaldırmak veya itmekTemiz bir tarak ile jel kenarlarına hem. Jel, oda sıcaklığında katılaşmaya izin verin. Örnek hazırlama örnek tamponu toplam RNA 1-10 ug ve 11.3 uL karıştırın. örnek tampon 11.3 uL RNA işaretleyici (1 mcg / ml) 2 ug karıştırın. 16 uL bir toplam hacimde 2.2.1 ve 2.2.2 örnekler nükleaz içermeyen su ilave edilir. 5 dakika boyunca 60 ° C de ısı ve daha sonra buzda. buz üzerinde / ul etidyum bromür 0.1 ug içeren izleme boya 4 uL ile 2.2.3 den örnek 16 mcL karıştırın. DİKKAT: Solunduğunda Ethidium bromür muhtemelen teratojenik ve toksiktir. etidyum bromür güvenlik formu okuyun. Elektroforez 10x MOPS 200 mL 1x MOPS çalışan tampon yapmak için GKD 2 O 1.800 ml tampon ekleyin. jel kuyu durulayın 1x MOPS çalışan tampon kullanın. Ön-run tO 5 dakika boyunca 20 V jel. Jelin kuyuların içine RNA örnekleri yükleyin. Işık maruz kalmasını önlemek için folyo ile örtün. (Gece ​​boyunca) yaklaşık 17 saat süre ile 35 V çalıştır Incelemek ve bir UV ışığı altında jel fotoğrafını. transfer Kullanılmayan kısmı kaldırmak için jel kesti. 10x SSC tamponu (20x SSC tamponu 250 mL DEPC su 250 mL) 500 mL hazırlayın. 50 rpm'de sallama ile 20 dakika için 10 x SSC tamponu ile iki kere jel yıkayın. Transfer tepsi (Şekil 1) transfer tamponu emen bir fitil kağıt, olarak hizmet verecek kadar büyük 1 filtre kağıdı sayfasını kesin. jel aynı boyutta filtre kağıdı 4 parça kesin. jel aynı boyuta pozitif yüklü bir naylon zar 1 sayfa kesin. jel üzerinde çentik ve, uygun yönlenmesinin sağlanması için bir işaretleyici olarak membran işaretleyin. 15 dakika boyunca 2 x SSC tamponu membran bekletin. 500 ml o dökünf 10x SSC transferi tepsisine tampon. cam levha üzerinde büyük filtre kağıdı sayfasını Lay ve transfer tamponu ile filtre kağıdı ıslatın. Bir pipet yardımıyla kabarcıkları dışarı rulo. transfer tamponuna önceden kesilmiş filtre kağıdı 2 adet ıslatın ve adım 2.4.5 filtre kağıdının ortasına koyun. herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak. aşağı filtre kağıdı üzerinde jel üst yan yattı. jel üstünde membran yerleştirin. jel ve membran çentikler aynı hizaya getirin. membran üstüne önceden kesilmiş filtre kağıdı 2 adet koyun ve transfer tamponu ile filtre kağıdı ıslatın. tabakalar arasındaki herhangi bir baloncukları giderin. havlu sadece jel ve zarından geçen tampon kadar emmek emin olmak için jel etrafında plastik wrap uygulayın. Filtre kağıdı üzerine kağıt havlu Stack. havlunun üstünde bir büyük boy cam plaka koyun. yığının üstüne bir ağırlık yerleştirin. RNA membrana jelden transfer etmek için gece boyunca devam edin. N 6 -methyladenosine 3. Algılama membran Çapraz bağlama 2x SSC tamponu nemli membran tutun. UV çapraz bağlayıcı içine 10x SSC tamponu ile dalmış filtre kağıdı 2 yaprak yerleştirin. RNA adsorbe tarafı yukarı bakacak şekilde, filtre kağıdının üstüne membran yerleştirin. "Autocrosslink modu" (120,000 μJ) seçin ve ışınlama başlatmak için "Başlat" düğmesine basın. membrana jelden RNA transferi onaylamak için UV jel görüntü alıcı ile membran ve jel inceleyin. Bağışıklık 1 saat boyunca oda sıcaklığında Tween 20 (TBST) tampon Tris-tamponlu tuzlu su içinde% 5 yağsız süt içinde membran engeller. 15 dakika boyunca TBST tamponu ile üç kez yıkayın. Gecede m 6 A (membran inkübe <em> K 6 -methyladenosine) antikor çözeltisi (1: 1000,% 5 yağsız süt TBST tamponu) 4 ° C'de ilave edildi. 15 dakika boyunca TBST tamponu ile üç kez membran yıkayın. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca (% 5 yağsız süt TBST tamponu içinde 2.000: 1) HRP ile konjüge edilmiş eşek anti-tavşan antikoru çözelti içinde membran inkübe edin. 15 dakika boyunca TBST tamponu ile üç kez membran yıkayın. Gelişmiş kemiluminesans substrat (membran cm2 başına 0.125 ml) uygulayın. Imalatçının talimatlarına 26 göre bir dijital kamera optimum ayarlarla kemilüminesans yakalar. m 6 A Niceleme ImageJ yazılımı kullanarak göreceli m 6 A kemilüminesan yoğunluğunu ölçmek. ImageJ yazılım menüsü altında ilgili dosyayı açmak için "Dosya" seçeneğini seçin. ImageJ gelen "Dikdörtgen" aracını seçin ve etrafında bir çerçeve çizinsinyaller. Ribozomal RNA deneyleri odağı değilse, hesaplama için 18S ve 28S ribozomal RNA m 6 A bantları kaçının. Seçilen şeritli onaylamak için "Command" ve "1" i tıklayın. Basın "Command" ve "3" Seçilen komplo göstermek için. "Düz" aracını tıklayın ve parçalı alanı ayırmak için çizgiler çizmek. ölçümleri kaydetmek için "Wand" aracını tıklayın. veri verir. Etidyum bromür boyama gelen 18S ribozomal RNA bant ile m 6 A düzeylerini normale.

Representative Results

Normal ışık-karanlık sirkadiyen fazda 14 gün sonra, vahşi tip farelerde sürekli karanlıkta yerleştirildi. karaciğer RNA'lar 4 saat aralıklarla numune ve modifiye Northern blot ile incelenmiştir. RRNA, mRNA ve küçük RNA'ların metilasyonu açık (Şekil 2) tespit edilmiştir. Farklı sirkadiyen saatler arasında karşılaştırma (BT) doğru 18S rRNA standardı ile hesaplanabilir. RRNA, mRNA ve küçük RNA'lar m 6 A düzeylerinin sağlam sirkadiyen salınım oldu. rRNA tarafından Sunulan girişimi önlemek için, poliadenile edilmiş RNA'lar aşama 1.2.2 gibi saflaştırılabilir. Saflaştırmadan sonra, rRNA, büyük ölçüde diğer RNA'lar (Şekil 3) daha iyi bir görünüm için izin ortadan kaldırılabilir. <stron g> Şekil 1: leke aktarma ünitesi montajı. zara RNA kurutma için kılcal aktarım ünitesi gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2: C57BL / 6J fareler m 6 A düzeyleri günlük ritim. Bu rakam, m 6 vahşi tip farelerin karaciğer toplam RNA'nın bir leke 4 saat aralıklarla normal ışık-karanlık fazın 14 gün sonra koyu, koyu fazının ilk gününde kurban gösterir. Miktar m 6 18S ve 28S rRNA arasındaki görüntü yoğunluk farkı kullanılarak yapıldı. M 6 A bolluk altındaki formaldehit jelden 18S rRNA bandına normalize edildi.et = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 3: ya rRNA olmadan m 6 A lekeler. Örnek m toplam RNA ve vahşi tip fare karaciğerinde poliadenile RNA 6 bir blotlar gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 1 10x MOPS tampon (pH 7.0, ışıktan koruma) MOPS 41.85 g 0.2 M Sodyum asetat 4.1 g 0.05 M EDTA, disodyum tuzu 3.7 g 0.01 M DEPC su Genel Toplam 1 L oda sıcaklığında karışmaya 2 20x SSC tamponu (pH 7.0) Sodyum klorit 175.3 g 3 M trisodyum sitrat 88.3 g 0.3 M DEPC su Genel Toplam 1 L </td> Oda sıcaklığında karıştırdıktan sonra otoklav 3 takip Boya 10x MOPS tamponu 500 ul 1x Ficoll 400 0.75 g % 15 mavi Bromophenol 0.01 g % 0.2 Ksilen siyanol 0.01 g % 0.2 DEPC su Genel Toplam 5 mL -20 ° C'de de 4 DEPC su 1'den oranı sulandırmak: DEPC ve 1,000 GKD 2 O Gece boyunca oda sıcaklığında karıştırdıktan sonra otoklav 5 Örnek tamponu (ışıktan korumak) 10x MOPS tamponu 200 ul % 37 formaldehid 270 ul formamid 660 ul -20 ° C'de de </tbody> Tablo 1: Tampon ve çözümleri.

Discussion

Modifications of RNA have important roles in cellular function and physiology. The current understanding of the regulation, function, and homeostasis of these modifications is still being explored and expanded⁸. Therefore, a precise and gold-standard method to evaluate the modifications of RNA is needed. The modified northern blotting method provides precise quantification of RNA modifications and clear delineation of the modifications in diverse RNAs. Although the method requires at least 3 days, it can be standardized and can be used in various experimental designs. Moreover, with different antibodies, it can detect different RNA modifications²⁷.

It is important to separate different RNAs when analyzing RNA modifications. Ribosomal RNA comprises a large portion of the total amount of RNA^28,29. The results from analyzing RNA modifications only in total RNA will represent mostly the changes of rRNA. Methylation and other such modifications of rRNA could potentially mask the changes in other RNAs. With the procedure of gel separation, the modifications of mRNA and other small RNAs can be more accurately analyzed.

Transcriptome-wide mapping with m⁶A immunoprecipitation and sequencing provides detailed insight into the modification of each type of RNA²². It provides information on the specific RNAs and a resolution of around 80-120 bp. Although m⁶A-Seq can compare the modifications between different experimental conditions, the selection of proper standards and controls for such experiments is difficult¹⁸. Immunoprecipitation is difficult to reproduce, often giving significant variations amongst repeats. Moreover, m⁶A-Seq requires the fragmentation of RNA samples before immunoprecipitation and sequencing³⁰. The fragmentation process could potentially induce undue influences on the original RNA modifications. If the experiment does not need the specific gene’s information but requires different conditions for comparison, the current method provides better visualization and control for diverse experimental setups.

Modification of RNA is an important step in regulating transcriptional control³¹. However, the homeostasis and the regulatory mechanisms of various RNA modifications under diverse physiological realms are still unclear. Using the present modified northern blotting method, different RNA modifications can be quantified and compared. Furthermore, the changes and regulations of RNA modifications can be investigated in greater detail. In the future, it could also be possible to combine the experimental data from both the classical northern blotting and the modified northern blotting protocols, providing greater insights into RNA biology.

The most important factor determining the success of the modified northern blotting protocol is the integrity of the RNA sample. RNAs with some amount of degradation may yield good classical northern blotting results, but this could potentially have significant impact on the modified northern blotting results. The modifications of RNA in different tissues or cell lines could also vary significantly. It is important to test the suitable RNA sample loads for different tissues before performing the final experiments.

As blotting procedures have been traditionally named after Dr. Southern and different geographical directions, we propose the name “northeastern” blotting for the current technique.

Materials

RNaseZap solution	Ambion	AM9782	Protocol 1.1
TRI Reagent solution	Ambion	AM9738	Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP)	Sigma	B9673	Protocol 1.2.1.3
Ethanol	JTbaker	8006	Protocol 1.2.1.3
Isopropanol	Sigma	I9516	Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit	Sigma	MRN70	Protocol 1.2.2.1
Glycogen	Ambion	AM9510	Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate	Fluka	71183	Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water	Ambion	AM9930	Protocol 1.2.2.6
DEPC	Sigma	D5758	Protocol 2.1.1
Agarose	JT Baker	A426	Protocol 2.1.2
MOPS	Sigma	M1254	Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution	Sigma	F8775	Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt	JT Baker	8993	Protocol 2.1.3 10X MOPS buffer
formamide	Sigma	F7503	Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker	Ambion	AM7150	Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide	Amresco	X328	Protocol 2.2.5
Ficoll 400	GE Healthcare	17-0300-10	Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue	Sigma	114391	Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol	Sigma	X4126	Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride	JT Baker	3624	Protocol 2.4.2 20X SSC buffer
Trisodium citrate	Sigma	S1804	Protocol 2.4.2 20X SSC buffer
filter paper	GE Healthcare	RPN6101M	Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane	GE Healthcare	RPN303B	Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400	Stratagene	400075	Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500	ANT Technology	Gel Catcher 1500	Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine)	Synaptic Systems	202003	Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab	GE Healthcare	NA934	Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System	BIO-RAD	1708280	Protocol 3.2.8