Een unieke rattenlever hilaire clamp model ontwikkeld voor het bestuderen van de effecten van farmacologische moleculen bij het verbeteren van ischemie-reperfusieletsel. Dit model omvat directe canulatie van het portaal toevoer naar het segment ischemische lever via een tak van de poortader, zodat hij direct hepatische afgifte.
Major lever chirurgie met instroom occlusie, en levertransplantatie, vereisen een periode van warme ischemie, en een periode van reperfusie leidt tot ischemie / reperfusie (I / R) letsel met talloze negatieve gevolgen. Potentiële I / R schade in marginale organen bestemd voor levertransplantatie uitmaken van de lopende donor tekort secundair aan een verminderde orgaan bezettingsgraad. Een grote behoefte bestaat om de lever I / R schade onderzoeken om het effect ervan op transplantaatfunctie bij transplantatie mediëren. Rattenlever hilaire klem modellen worden gebruikt om het effect van verschillende moleculen op lever I / R schade onderzocht. Afhankelijk van het model, zijn deze moleculen geleverd via inhalatie, epidurale infusie, intraperitoneale injectie, intraveneuze toediening of injectie in de perifere ader mesenterica superior. Een rattenlever hilaire klem model werd ontwikkeld voor het bestuderen van de effecten van farmacologische moleculen bij het verlichten van I / R schade. de described model rattenlever hilaire klem omvat directe canulatie van het portaal levering aan de lever ischemische segment via een zijtak van de poortader, zodat hij direct segmentale hepatische afgifte. Onze benadering is om ischemie te induceren in de linker laterale en middelste lobben gedurende 60 min, gedurende welke tijd de bestudeerde stof wordt toegediend. In dit geval, gepegyleerd superoxide dismutase (SOD-PEG), een vrije radicaal scavenger, direct geïnfuseerd in de ischemische segment. Deze reeks experimenten toont aan dat infusie van PEG-SOD is beschermend tegen lever I / R schade. Voordelen van deze benadering omvatten directe injectie van het molecuul in het ischemische segment daaruit voortvloeiende verlaging in distributievolume en vermindering van systemische bijwerkingen.
Major lever chirurgie met instroom occlusie, en levertransplantatie, vereisen een periode van warme ischemie, en een periode van reperfusie leidt tot ischemie / reperfusie (I / R) letsel 1. De gevolgen van I / R schade in de lever zijn uitgebreid 1, 2, 3 beschreven. Gevolgen van I / R schade beschreven in de literatuur omvatten: het genereren van reactieve zuurstofspecies, initiatie van de inflammatorische cascade waaronder activering van neutrofielen, Kupffer-cellen en endotheliale cellen, activering van het heem oxygenase systeem en activatie van Toll-like receptoren, een onbalans tussen endotheline en stikstofmonoxide activering van nucleaire factor-kB en stimulering van pro-inflammatoire cytokine en adhesiemoleculen synthese 1, 2, 3. Deze proinflammatoire gebeurtenissen kunnen lead apoptose, necrose, orgaanfalen en uiteindelijk orgaanfalen 3.
I / R schade in organen die bestemd zijn voor levertransplantatie kan leiden tot vroegtijdige transplantaatverlies en draagt bij aan de huidige donor tekort marginaal organen zijn gevoeliger voor schade 3. Er zijn momenteel 15.226 potentiële ontvangers op de wachtlijst voor levertransplantatie in de Verenigde Staten 4 en slechts 5950 lever transplantaties werden uitgevoerd in 2015 5. Als gevolg van deze extreme beperkingen in de beschikbaarheid van organen, onderzoek het verkennen van de lever I / R schade is nodig om graft function en orgel gebruik te optimaliseren.
Diermodellen vroeger lever I / R schade studie omvatten rat hilaire klem modellen en ratten levertransplantatie modellen. Er zijn een verscheidenheid van rat hilar klem modellen die nu in gebruik is. De meest voorkomende is er een waarin de poortader, leverslagader en gal duct toevoeren van het linker laterale en middelste lobben geklemd gebruikt microchirurgische klemmen 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 gedurende 30 tot 60 min 6, 7, 10, 13, 14, en vervolgens een periode van reperfusie van 60 min 24 uur 7, 9, 10, 13, 14 wordt toegelaten. De linker laterale en middelste lobben van de rattenlever omvatten ongeveer 70% van de hepatische parenchym 9. Sommige protocollen ontworpen om ischemische preconditionering studie omvatten intermitterende klemming van het hilar vaartuigenof de achterste ledematen voorafgaand aan een langere ischemie geïnduceerd door klemmen de hilaire vaten 9, 13. Er zijn ook verschillende modificaties in de literatuur beschreven. De eerste is om de poortader en leverslagader toevoeren van het linker laterale en middelste lobben klem, maar exclusief de galwegen 15. Een tweede modificatie aan totale hepatische ischemie induceren door het klemmen van de poortader en leverslagader galkanaal vóór de scheiding 16, 17, 18, 19, 20. Een derde modificatie omvat klemming van de hilaire vaten rechts kwab gedurende 30 tot 60 min 8. Een extra modificatie omvat het klemmen van de vaatbundels in één achterpoot om letsel te induceren in de lever 13, 21 </sup>. Verschillende benaderingen voor het hilar clamp procedure zijn weergegeven in Figuur 1A-D.
Rattenlever hilaire klem modellen werden gebruikt om het effect van verschillende moleculen en verbindingen op lever I / R studie. Afhankelijk van het model gebruikte deze moleculen zijn geleverd via inhalatie 11, epidurale infusie 12, intraperitoneale injectie 17, 18, 21, 22, intraveneuze toediening 10, 14, 15, 19, 23, 24 of injectie in de ader perifere mesenterica superior 8 .
Het model voor rattenlever hilaire klem die in dit verslag includes directe canulatie van het portaal levering aan het ischemische segment via een zijtak van de poortader (figuur 2), waardoor directe segmentale hepatische afgifte van farmacologische stoffen onder studie. Onze benadering is om ischemie te induceren in de linker laterale en middelste lobben gedurende 60 min, gedurende welke tijd een infusie van de bestudeerde stof, in casu gepegyleerd superoxide dismutase, een vrije radicaal scavenger 25, direct geïnfuseerd in de ischemische segment . Bloedmonsters worden genomen voorafgaand aan inductie van ischemie en 120 min na reperfusie. Op dit punt wordt de rat opgeofferd en monsters worden genomen van links mediaan lobben. Bovendien worden monsters genomen uit de rechter kwab te dienen als een interne controle.
Er zijn tal van voordelen aan deze aanpak. Allereerst, wanneer de farmacologische stof bestudeerde direct worden geïnjecteerd in het ischemische volume segment of distributie is vrij laag vergeleken met het distributievolume van injectie in de systemische circulatie van de peritoneale ruimte. Bovendien is deze benadering vermindert, maar elimineert niet de mogelijkheid van systemische bijwerkingen.
Deze reeks experimenten toonden dat injectie van PEG-SOD in de linker en middelste lobben leidde tot een significante daling in de afgifte van ALT, lipideperoxidatie van celmembranen (MDA) en het onderhoud van glutathion (GSH) in vergelijking met controles (normale zoutoplossing ). Leverweefsel transaminasen zoals alanineaminotransferase (ALT) zijn vastgesteld markers van hepatocellulaire schade. De afname van ALT wanneer de linker kwab geïnjecteerd met PEG-SOD suggereert een beschermend effect van PEG-SOD. Verhoogde weefsel MDA geeft verhoogd lipidenperoxidatie en wordt beschouwd als een marker van oxidatieve stress en weefselbeschadiging. Overproductie van reactieve zuurstofsoorten leidt tot een hogere productie van MDA 26. De significante vermindering van MDA weefsel in de linker en middelste lobben van het dier na injectie met PEG-SOD toont een beschermend effect van PEG-SOD. Dit is in overeenstemming met de huidige kennis die PEG-SOD beschermt de cellen tegen beschadigingveroorzaakt door gedeeltelijk gereduceerde reactieve zuurstofsoorten 27. Bovendien, in aanwezigheid van reactieve zuurstofspecies, glutathion disulfide gereduceerd glutathion (GSH) 28. Het onderhoud van GSH in de linker en middelste lobben van de lever geïnjecteerd met PEG-SOD verder versterkt het beschermende effect van PEG-SOD. Bovendien is aangetoond dat er een toegenomen gesplitst caspase-3, een product van apoptose, in het weefsel blootgesteld aan ischemie-reperfusieschade. De daling van gesplitst caspase-3 in de linker kwab bij behandeling met PEG-SOD suggereert dat PEG-SOD leidt tot een afname in apoptose.
Superoxide dismutase (SOD) is een essentieel enzym in de detoxificatie van reactieve zuurstofsoorten. Het enzym katalyseert de omzetting van beide superoxide anionen tot waterstofperoxide en water. Het enzym catalase zet dan waterstofperoxide in water en zuurstof volledig met behulp 25. De halfwaardetijd vannatief SOD beperkt het gebruik ervan in experimentele modellen tot de ontwikkeling van geconjugeerde polyethyleenglycol-superoxidedismutase (SOD-PEG). Conjugatie van SOD polyethyleenglycol verhoogt de halfwaardetijd van 6 min tot 14 h. Nguyen et al. aangetoond in staat te lipideperoxidatie milderen hepatische ischemie bij een rattenmodel gebruikt systemische afgifte 29.
Er zijn een verscheidenheid van mogelijke wijzigingen van de techniek hier beschreven en sommige zijn eerder beschreven in de literatuur. Afhankelijk van het gebruikte model molecules zijn bezorgd via inhalatie 11, epidurale infusie 12, intraperitoneale injectie 17, 18, 21, 22, intraveneuze toediening 10, 14, 15 <sup>, 19, 23, 24 of injectie in de perifere ader 8 mesenterica superior.
Er zijn een aantal cruciale stappen in dit protocol. De belangrijkste is de canule van de poortader. Zorg moet worden genomen dat het gat in de ader cut niet te groot is. Het weefsel is zeer elastisch en het gat te vergroten op zichzelf. We adviseren om te beginnen door het snijden van een gat dat is 0,5 mm met de microchirurgische schaar. De canule kan worden toegevoerd door de opening met een instrument waarmee een grotere flexibiliteit dan wanneer proberen om dit gedeelte van de procedure uit te voeren met de hand. Bovendien, terwijl aanvankelijk voeden van de canule, moet direct gericht op de vertakking van de linker en rechter poortaderen vermijden poking een gat in de achterwand van de ader. Wanneer de cannule tip de vertakking bereikt, kan vervolgens worden ingebracht in de linker ader specifiekebondgenoot. Zodra de canule in de vena linkerportaal, die zowel links als mediaan lobben levert wordt toegevoerd, kan de positie handmatig worden bevestigd door voelen in de ader. De positie kan ook worden bevestigd door het injecteren van een kleine hoeveelheid koude zoutoplossing en het zien van het blancheren effect op de bijgeleverde segmenten van de lever.
De lever hilaire klem bij ratten verschaft een reproduceerbare en stabiele platform voor het aantonen van hepatische ischemie-reperfusieletsel. Variabele hilaire clamp modellen zijn gebruikt door onderzoekers om de beschermende effecten van anti-oxidanten en andere kleine moleculen 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 bestuderen. Nuttige variaties omvatten welke vaartuigen zijn clamp ed, welk segment ischemische worden gemaakt, ongeacht of de galwegen wordt opgenomen en de duur van de periode van reperfusie 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Bovendien, als dit model wordt gebruikt om het effect van toediening van een molecule de toedieningsweg bestuderen ook heterogeen 8, 10, 11,"> 12, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24. Er zijn verschillende voordelen van de beschreven aanpak. Ten eerste directe canulatie van het portaal levering aan de ischemische segment staat een rechtstreekse segmentale hepatische afgifte van de farmacologische stof bestudeerde. Hierdoor kan het gebruik van andere lobben van de lever als een interne controle. Ten tweede, segmentale hepatische cannulatie zorgt voor een verminderde verdelingsvolume van het molecuul bestudeerd. Deze benadering vermindert daardoor het risico op systemische bijwerkingen de stof wordt direct geïnjecteerd in de lever interessante segment. direct canulatie van de lever segment zorgt voor de stof af te geven pre-ischemie, Intra-ischemie of post-ischemie. Dit zorgt voor een studie van het effect van het molecuul op elk punt in de ischemie-reperfusie letsel cyclus. Met de toegenomen lengte van de ischemische en een hogere mate van letsel extra mogelijkheid op de leverregeneratie studeren beschikbaar zou zijn.
Er zijn ook enkele beperkingen van deze aanpak. De eerste is de start-up kosten. De aankoop van een chirurgische microscoop kan een belangrijke start-up kosten voor een lab dat niet reeds men bezitten. Deze techniek kan het moeilijk of onmogelijk zonder een microscoop. De tweede is de leercurve de tijd. Hoewel deze procedure is relatief eenvoudig is het vereist enige oefening en het is waarschijnlijk dat een beginner een aanzienlijk aantal procedures zal nodig hebben om een expert te worden.
Kortom, dit model zorgt voor een reproduceerbare, eenvoudig en kosteneffectief platform om de lever ischemie-reperfusie letsel te bestuderen. Hoewel in het protocol beschreven polyethyleen glycol-superoxide dismutase, een vrije radicaal scavenger 25, werd geïnfuseerd, kan dit model worden gebruikt om een verscheidenheid van verschillende farmacologische stoffen doordringen om hun effecten op I / R schade aan de lever te evalueren.
The authors have nothing to disclose.
We willen graag Dennis Mathias erkennen voor zijn illustratieve werk. Dit werk werd ondersteund door NIH T32AI 106704-01A1 en T. Flesch Fund for Organ Transplantation, perfusie, Engineering and Regeneration aan de Ohio State University.
Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 200- 250 grams | |
Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
Isoflurane Molecular Weight 184.5 | Piramal Healthcare | ||
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
Oxygen | Praxair | 98015 | |
27-0 Micro-Cannula | Braintree Scientific | MC-28 | |
Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
Polyethylene Glycol – Superoxide Dismutase (PEG-SOD) | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
GenieTouch | Kent Scientific | ||
Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
4×4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
Microsurgical Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
Forceps – Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
Forceps – Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
Scissors – non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
Forceps – Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
Other Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Mosquito Clamps | Generic | ||
Analysis | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alannine aminotransferase (ALT) assay | Biovision | K752-100 | |
Malondialdehye (MDA) assay | Abcam | ab118970 | |
Glutathione (GSH) assay | Cayman Chemical | 7030002 | |
Antibodies – Cleaved Caspase-3 and Actin | Cell Signaling Tecnology | Antibody 9661 | |
ImageJ Software | National Institutes of Health | ||
RIPA Lysis and Extraction Buffer | Millipore | 10-188 |