고유 한 쥐의 간 문부 클램프 모델은 허혈 – 재관류 손상을 완화의 약물 분자의 영향을 연구하기 위해 개발되었다. 이 모델은 직접 간 전송을 허용, 포털 정맥의 지점을 통해 허혈성 간 세그먼트 포털 공급의 직접 삽관이 포함되어 있습니다.
유입 폐색, 간 이식 주요 간 수술, 따뜻한 국소 빈혈의 기간 및 허혈 / 재관류 (I / R) 무수히 많은 부정적인 결과와 부상으로 이어지는 재관류의 기간을 필요로한다. 간 이식 향하는 한계 기관의 잠재적 인 I / R 손상은 감소 장기 가동률에 차 현재 기증자 부족에 기여한다. 중요한 필요가 이식에서 이식 기능에 미치는 영향을 중재하기 위해 간 I / R 부상을 탐험하기 위해 존재한다. 쥐의 간 문부 클램프 모델 간 I / R 손상에 다른 분자의 영향을 조사하기 위해 사용된다. 모델에 따라, 이들 분자는 주변 장간막 정맥 내로 흡입, 경막 외 주입, 복강 내 주사, 정맥 내 투여 또는 주사하여 전달 하였다. 쥐의 간 문부 클램프 모델은 I / R 손상을 완화의 약물 분자의 영향을 연구에 사용하기 위해 개발되었다. describ쥐 간 문부 클램프 용 ED 모델 직접 분절 간 전송을 허용 간문맥의 곁가지를 통해 허혈성 간장 세그먼트 포털 공급 직접 캐 뉼러를 포함한다. 우리의 접근 방식은 연구 대상 물질이 주입되는 시간 동안 60 분 동안 왼쪽 측면과 중앙 로브에 허혈을 유도하는 것입니다. 이 경우, 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 – 페 길화는 (PEG-SOD), 자유 라디칼 스 캐빈 저는, 허혈성 세그먼트에 직접 주입된다. 실험이 시리즈는 PEG-SOD의 주입이 간 I / R 손상에 대한 보호는 것을 보여줍니다. 이 방법의 이점은 전신 부작용의 감소 및 분포의 용적 감소와 그에 허혈성 세그먼트로 분자의 직접적인 주입을 포함한다.
유입 폐색, 간 이식 주요 간 수술, 따뜻한 국소 빈혈의 기간 및 허혈 / 재관류 (I / R) 부상 1에 이르는 재관류의 기간을 필요로한다. 간에서 I / R 손상의 결과는 광범위하게 1, 2, 3 설명하고있다. I의 결과는 / 문헌에 상세히 R 부상을 포함한다 : 반응성 산소 종의 생성을, 호중구 활성화, 쿠퍼 세포, 내피 세포, 수신자와 같은 수용체의 헴 옥 시게나 제 시스템의 활성화 및 활성화 포함한 염증성 캐스케이드의 개시 엔도 텔린과 산화 질소, 핵 인자 κB의 활성화 및 전 염증성 사이토 카인 및 부착 분자의 합성 1, 2, 3 사이의 불균형의 촉진. 이 염증성 이벤트 리터 수도세포 사멸, 괴사, 장기 기능 장애 및 궁극적으로 장기 부전 3 EAD.
나는 / 간 이식 향하는 기관의 R 손상은 초기 이식 손실로 이어질과 한계 장기 부상 3에 더 취약으로 현재 기증자 부족에 기여 할 수 있습니다. 2015 5에서 수행 된 미국 4에서 간 이식 대기 목록에 15,226 잠재적 인 수신자 만 5950 간 이식은 현재이 있습니다. 때문에 장기 가용성이 극단적 인 제한으로 연구 간 I / R 손상이 이식 기능과 기관의 활용을 최적화하기 위해 필요한 탐구.
간 I / R 부상을 연구하는 데 사용 동물 모델 쥐 문부 클램프 모델과 쥐의 간 이식 모델을 포함한다. 현재 사용중인 쥐 문부 클램프 다양한 모델이있다. 가장 일반적인 하나 인 문맥, 간동맥 및 담즙 뒤CT 왼쪽 측면 및 중간 엽이 미세 수술 클립 6, 7, 8, 9, 10, 11, 60 분의 재관류 30 다음 최소 6, 7, 10, 13, 14 및 60 동안 12를 이용하여 고정되어 공급 H 7, 9, 10, 13 (24), (14)가 허용된다. 래트 간 왼쪽 측면 및 중간 엽이 간 실질 (9)의 약 70 %를 포함한다. 허혈 양상을 연구하기위한 일부 프로토콜은 문부 혈관의 간헐적 인 클램핑을 포함또는 폐문 용기 (9), (13)를 클램핑에 의해 유도 된 허혈성 장기간에 뒷다리 종래. 문헌에 기술 된 몇 가지 수정이있다. 첫 번째는 좌측 측면 및 중간 엽 공급 문맥과 간동맥 클램프 있지만 담관 (15)를 제외한다. 제 2 변형은 종래 디비전 16, 17, 18, 19, 20 간문맥, 간동맥 및 담관 클램핑하여 총 간 허혈을 유도하는 것이다. 제 3 변형은 30~60 분 8 오른쪽 로브의 폐문 혈관 클램프를 포함한다. 추가의 변형, 21 간 13에 손상을 유도하기 위해 하나 개 뒷다리의 관다발 클램핑 포함 </suP>. 폐문 클램프 절차에 대한 다양한 접근 방법이도 1a-D에 도시되어있다.
쥐 간 문부 클램프 모델 간 I / R에 다른 분자 및 화합물의 효과를 연구하기 위해 사용되었다. 주연 장간막 정맥 (8)로 흡입 (11), 경막 외 주입 (12), 복강 내 주사 17, 18, 21, 22, 정맥 내 투여 10, 14, 15, 19, 23, 24 또는 주입을 사용하여 전달 된 이들 분자 모델에 사용 따라 .
이 보고서에 포함하여에 설명 된 쥐의 간 문부 클램프의 모델연구중인 약물 물질의 직접 분절 간 전송을 허용 문맥의 곁가지를 통해 허혈성 세그먼트 포털 공급 (도 2), 직접 삽관을 말이지. 우리의 방법은이 경우의 연구 대상 물질의 주입, 페 길화 슈퍼 옥사이드 디스 뮤타 아제, 자유 라디칼 스 캐빈 저 (25), 허혈성 세그먼트에 직접 주입하는 동안, 60 분 동안 왼쪽 측면 및 중간 엽에서 허혈을 유도하는 . 혈액 샘플은 허혈 유도 전에 및 120 분 후 재관류에서 촬영된다. 이 시점에서, 쥐가 희생되고 샘플은 왼쪽과 중간 엽에서 가져옵니다. 또한, 샘플은 내부 제어 역할을 오른쪽 로브에서 촬영된다.
이 방법에 많은 장점이 있습니다. 무엇보다도, 연구중인 약물 물질 직접 허혈성 부분에 주입 될 수있는 볼륨 OF 분포는 전신 순환에 주입 분배의 부피 또는 복강에 비해 상당히 낮다. 또한,이 방법은 감소, 전신 부작용의 가능성을 배제하지 않는다.
이러한 일련의 실험이 증명이 대조군에 비해 왼쪽으로 PEG-SOD 및 ALT의 방출에 크게 감소되었다 중간 엽, 세포막의 지질 과산화 (MDA)와 글루타치온의 유지 (GSH)의 주입 (생리 식염수 ). 알라닌 아미노 전이 효소 (ALT)를 포함한 간 조직 트랜스 아미나은 간세포 손상의 마커를 설정됩니다. 좌측 엽 PEG-SOD 주입되는 ALT의 감소는 PEG-SOD의 보호 효과를 시사한다. 증가 된 조직 MDA는 지질 과산화를 증가 나타냅니다 산화 스트레스 및 조직 손상의 마커 간주됩니다. 활성 산소의 과잉 생산은 MDA (26)의 생산의 증가를 야기한다. PEG-SOD 주입 한 동물의 좌측 및 중간 엽 조직에서 MDA의 현저한 감소는 PEG-SOD의 보호 효과를 보여준다. 이 PEG-SOD는 손상으로부터 세포를 보호하는 현재의 이해와 일치부분적으로 감소 된 반응성 산소 종 (27)에 의해 발생. 또한, 활성 산소 종의 존재 하에서, 글루타치온 디설파이드 글루타티온 (GSH) (28)로 감소된다. 상기 PEG-SOD 주사 간 좌측 및 중간 엽에서 GSH에서 유지 PEG-SOD의 보호 효과를 강화한다. 또한 허혈 재관류 손상에 노출 된 조직에서, 절단 된 카스파 제 3, 아폽토시스의 생성물이 증가한다는 증명된다. PEG-SOD 처리 좌측 엽 절단 된 카스파 제 -3의 감소는 PEG-SOD는 세포 자멸의 감소에 이르게 것을 시사한다.
과산화물 디스 뮤타 아제 (SOD)의 활성 산소 종의 중독에서 중요한 효소이다. 효소는 과산화수소와 물로 두 수퍼 옥사이드 음이온의 전환을 촉매한다. 효소 카탈라제는 프로세스 (25)를 완성 물 및 산소를 과산화수소로 변환한다. 의 반감기네이티브 SOD 공액 폴리에틸렌 글리콜 – 슈퍼 옥사이드 디스 뮤타 아제 (SOD-PEG)의 개발까지 실험 모델에서의 사용을 제한했다. 폴리에틸렌 글리콜에 컨쥬 게이션 SOD의 14 시간을 6 분에서의 반감기를 증가시킨다. 구엔은 등. 전신 배달 (29)를 사용하여 쥐 모델에서 간 허혈에서 지질 과산화를 완화 할 수있는 능력을 보여 주었다.
기술 여기에 설명 된 일부는 이전에 문헌에 기술 된 잠재적 인 수정의 다양한있다. 모델에 사용 된 분자에 따라 흡입 (11), 경막 외 주입 (12), 복강 내 주사 17, 18, 21, 22, 정맥 내 투여 10, 14, 15을 사용하여 전달 된 <su주연 장간막 정맥 내로 8> P, 19, 23, 24 또는 주사.
이 프로토콜에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 가장 중요한 것은 문맥의 삽관입니다. 치료는 정맥을 잘라 구멍이 너무 크지 않도록주의해야합니다. 조직은 매우 탄력적 및 정공은 자체적으로 확대된다. 우리는 미세 수술 가위로 0.5 mm 인 구멍을 절단하여 시작하는 것이 좋습니다. 캐 뉼러는 손 절차의 일부를 수행하려는 경우보다 민첩성 허용하는기구를 사용하여 구멍을 통해 공급 될 수있다. 처음에 캐 뉼러를 공급하면서 또한, 정맥의 뒤쪽 벽에 구멍을 파고 않도록 좌우 포털 정맥의 분기점을 향해 직접 겨냥한다. 캐뉼라 팁 분기점에 도달하면, 그 다음 특정 왼쪽 정맥 내로 공급 될 수있다동맹국. 정맥은 왼쪽과 중간 엽을 모두 공급하는 왼쪽 포털 정맥에 공급되면, 그 위치는 정맥 내부를 느낌에 의해 수동으로 확인할 수 있습니다. 그 위치는 간장의 공급 세그먼트의 창백 효과를 차가운 생리 식염수를 소량 주입으로보고 확인할 수있다.
쥐의 간 문부 클램프 모델 간 허혈 – 재관류 손상을 입증하기위한 재현하고 안정적인 플랫폼을 제공합니다. 가변 폐문 클램프 모델은 산화 방지제 및 다른 작은 분자가 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14의 보호 효과를 연구하는 연구자들이 사용되어왔다. 변화 점은 혈관 클램프를 포함 할 수 있습니다 담관이 포함되어 있는지의 여부 허혈성 만들어진 세그먼트 ED, 재관류 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18의 기간의 길이, 19, 20, 21. 이 모델은 분자 투여 경로 투여의 영향을 연구하기 위해 사용되는 경우 또한 이기종 8, 10, 11,"> 12, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24. 상술 한 방법에 몇 가지 장점이있다이. 우선, 허혈성 세그먼트 포털 공급 직접 캐 뉼러에 직접 분절 간 전송을 허용 연구중인 약물 물질. 이것은 내부 제어로서 간 다른 돌출부의 이용을 허용한다. 둘째, 분절 간 삽관이 검토되고 분자에 대한 분포의 감소 된 용적을 허용한다. 이러한 접근하여 같은 전신 부작용의 위험을 줄일 물질이. 관심 간 세그먼트에 직접 주입 간 세그먼트의 직접 삽관 전 허혈을 제공하는 물질을 가능하게한다, 내 허혈 후 허혈. 이는 허혈 – 재관류 손상 사이클의 어느 지점에서 분자의 효과를 연구 할 수 있습니다. 허혈성 시간의 증가 길이 가능한 것 간 재생을 연구하는 부상 추가적인 기회의 증가 수준.
이 방법의 몇 가지 제한이있다. 첫 번째는 창업 비용이다. 수술 현미경의 구입은 이미 하나를 가지고 있지 않는 실험실의 중요한 시작 비용이 될 수 있습니다. 이 기술은 현미경없이 어렵거나 불가능할 수있다. 두 번째는 곡선 시간을 배우고있다. 이 절차는 비교적 간단하지만 그것은 연습이 필요하며 만약 초보자가 전문가가되기 위해 절차의 상당수를 필요로 할 것 같다.
요약하면,이 모델은 간 허혈 – 재관류 손상을 연구하기 위해, 재현 간단하고 비용 효율적인 플랫폼을 수 있습니다. 프로토콜에 폴리에틸렌 GL 여기 설명되었지만ycol – 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제, 자유 라디칼 스 캐빈 저 (25), 주입 된이 모델은 간에서 I / R 손상에 미치는 영향을 평가하기 위해 다른 약물 물질의 다양한 주입하는 데 사용할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 그의 설명 작업 데니스 마티아스을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 NIH T32AI 106704-01A1와 오하이오 주립 대학의 장기 이식, 관류, 엔지니어링 및 재생을위한 T 플레쉬 기금에 의해 지원되었다.
Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 200- 250 grams | |
Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
Isoflurane Molecular Weight 184.5 | Piramal Healthcare | ||
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
Oxygen | Praxair | 98015 | |
27-0 Micro-Cannula | Braintree Scientific | MC-28 | |
Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
Polyethylene Glycol – Superoxide Dismutase (PEG-SOD) | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
GenieTouch | Kent Scientific | ||
Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
4×4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
Microsurgical Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
Forceps – Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
Forceps – Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
Scissors – non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
Forceps – Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
Other Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Mosquito Clamps | Generic | ||
Analysis | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alannine aminotransferase (ALT) assay | Biovision | K752-100 | |
Malondialdehye (MDA) assay | Abcam | ab118970 | |
Glutathione (GSH) assay | Cayman Chemical | 7030002 | |
Antibodies – Cleaved Caspase-3 and Actin | Cell Signaling Tecnology | Antibody 9661 | |
ImageJ Software | National Institutes of Health | ||
RIPA Lysis and Extraction Buffer | Millipore | 10-188 |