Ein einzigartige Rattenleber hilar Clamp-Modell wurde für die Untersuchung der Auswirkungen von pharmakologischen Molekülen in Lindern Ischämie-Reperfusionsschaden entwickelt. Dieses Modell beinhaltet direkte Kanülierung der Portal Versorgung des ischämischen Lebersegment über einen Zweig des Pfortader, was eine direkte hepatische Lieferung.
Wichtige Leberchirurgie mit Zufluss Okklusion und Lebertransplantation erforderlich macht eine Periode warmer Ischämie und über einen Zeitraum von Reperfusion Ischämie / Reperfusion (I / R) Verletzungen mit unzähligen negativen Folgen führen. Potential I / R-Schaden in marginal Organen für eine Lebertransplantation bestimmt trägt zum Stromgeber Mangel sekundär zu einer verringerten organ Nutzungsrate. Ein erheblicher Bedarf besteht hepatischen I / R-Schaden zu erforschen, um ihre Auswirkungen auf die Transplantatfunktion in der Transplantationsmedizin zu vermitteln. Rattenleber hilar Klemm Modelle werden verwendet, um die Auswirkungen verschiedenen Moleküle auf dem Leber-I / R-Schaden zu untersuchen. Je nach Modell sind diese Moleküle geliefert wurden unter Verwendung von Inhalation, epidurale Infusion, intraperitoneale Injektion, die intravenöse Verabreichung oder Injektion in die periphere mesenterica superior. Eine Rattenleber hilar Klemme Modell wurde bei der Untersuchung der Auswirkungen von pharmakologischen Molekülen in Lindern I / R-Schadens für den Einsatz entwickelt. die described Modell für hilar Klemmrattenleber enthält direkte Kanülierung der Portal Versorgung für hepatische Lieferung direkt segmental zum ischämischen Lebersegment über einen Seitenzweig der Pfortader, ermöglicht. Unser Ansatz ist Ischämie in den linken lateralen und mittleren Lappen für 60 min zu induzieren, während welcher Zeit der untersuchten Substanz infundiert wird. In diesem Fall pegyliertes-Superoxid-Dismutase (PEG-SOD), ein Radikalfänger, wird direkt in das ischämische Segment infundiert. Diese Versuchsreihe zeigt, dass die Infusion von PEG-SOD ist Schutz gegen Leber I / R-Schaden. Vorteile dieses Ansatzes umfassen direkte Injektion des Moleküls in das ischämische Segment mit daraus folgenden Abnahme der Verteilungsvolumen und eine Verringerung der systemischen Nebenwirkungen.
Hauptleberchirurgie mit Einströmen Okklusion und Lebertransplantation erfordert eine Periode warmer Ischämie und Reperfusion über einen Zeitraum von Ischämie / Reperfusions (I / R) Verletzungen führenden 1. Die Folgen des I / R – Schadens in der Leber wurden umfassend 1, detailliert 2, 3. Folgen der I / Detail R Verletzungen in der Literatur sind: Erzeugung von reaktiver Sauerstoffspezies, die Einleitung der Entzündungskaskade, einschließlich der Aktivierung von Neutrophilen, Kupffer-Zellen und Endothel-Zellen, die Aktivierung des Häm-Oxygenase-Systems und die Aktivierung der Toll-like-Rezeptoren, einem Ungleichgewicht zwischen Endothelin und Stickstoffmonoxid, die Aktivierung von nuclear factor & kgr; B, und die Förderung von entzündungsfördernden Cytokinen und Adhäsionsmolekül Synthese 1, 2, 3. Diese proinflammatorischen Ereignisse können lead zur Apoptose, Nekrose, Organfehlfunktion und schließlich Organversagen 3.
I / R – Schaden in Organen für eine Lebertransplantation bestimmt kann zu frühen Verlust des Transplantats führen und trägt zur aktuellen Spendermangel als marginal Organe anfälliger für Verletzungen 3 sind. Es gibt zur Zeit 15.226 potenzieller Empfänger auf der Warteliste für eine Lebertransplantation in den Vereinigten Staaten von Amerika 4 und nur 5.950 Lebertransplantationen im Jahr 2015 5 durchgeführt wurden. Durch diese extreme Einschränkung der Organverfügbarkeit, Erforschung Forschung hepatischer I / R-Schaden ist erforderlich, um die Organfunktion und Organauslastung zu optimieren.
Tiermodelle verwendet, um Leber I / R Verletzungen gehören Ratte hilar Klammer Modelle und Rattenlebertransplantationsmodellen zu untersuchen. Es gibt eine Vielzahl von Ratten hilar Klemm Modellen derzeit im Einsatz. Die häufigste ist eine, in der die Pfortader, Leberarterie und Gallen duct Zuführen der linken lateralen und medianen Lappen verklemmt werden unter Verwendung mikrochirurgisches Klammern 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 für 30 bis 60 min 6, 7, 10, 13, 14 und dann auf einem Zeitraum der Reperfusion von 60 min bis 24 h 7, 9, 10, 13, 14 erlaubt. Die linken lateralen und medianen Keulen der Rattenleber umfassen etwa 70% des Leberparenchym 9. Einige Protokolle entworfen ischämische Präkonditionierung zu untersuchen sind intermittierende Verspannung der hilar Gefäßeoder der Hintergliedmaße vor längerer Ischämie induziert durch die hilar Gefäße Klemm 9, 13. Darüber hinaus gibt es in der Literatur beschrieben sind mehrere Modifikationen. Die erste ist , die Pfortader und Leberarterie Versorgung der linken lateralen und medianen Keulen klemmen, jedoch ausgenommen den Gallengang 15. Eine zweite Modifikation ist durch Einklemmen der Pfortader, Leberarterie und Gallengang vor ihrer Teilung 16, 17, 18, 19, 20 insgesamt hepatischer Ischämie zu induzieren. Eine dritte Modifikation umfasst Klemmung der hilar Gefäße rechten Lappen für 30 bis 60 min 8. Eine weitere Modifikation betrifft in einem Hinterbeine 13 , um Verletzungen in der Leber zu induzieren , das Gefäßbündel Klemm, 21 </sup>. Verschiedene Ansätze zur hilar Klemmverfahren sind in 1A-D dargestellt.
Rattenleber hilar Klemm Modelle wurden verwendet, um die Auswirkungen verschiedenen Moleküle und Verbindungen auf dem hepatischen I / R zu studieren. Je nach Modell verwendet wurden , hat diese Moleküle geliefert Inhalation mittels 11, epidurale Infusion 12, intraperitoneale Injektion 17, 18, 21, 22, intravenöse Verabreichung 10, 14, 15, 19, 23, 24 oder Injektion in die peripheren mesenterica superior 8 .
Das Modell für hilar Klemme Rattenleber in diesem Bericht includ detailliertES direkte Kanülierung der Portal Versorgung des ischämischen Segment über einen Seitenzweig der Pfortader (Abbildung 2), die für die direkte segmentale hepatische Lieferung der pharmakologischen Substanz in Untersuchung ermöglicht. Unser Ansatz ist Ischämie in den linken lateralen und medianen Keulen für 60 min zu induzieren, während welcher Zeit eine Infusion der Substanz untersucht, in diesem Fall pegyliertes-Superoxid – Dismutase, ein Radikalfänger 25 wird direkt in das ischämische Segment infundiert . Die Blutproben werden vor der Induktion der Ischämie und bei 120 min nach der Reperfusion entnommen. An diesem Punkt wird die Ratte getötet und Proben werden von den linken und mittleren Lappen genommen. Zusätzlich werden Proben aus dem rechten Lappen genommen als interne Kontrolle zu dienen.
Es gibt zahlreiche Vorteile dieses Ansatzes. In erster Linie, wenn die pharmakologische Substanz zu untersuch direkt das Volumen o in das ischämische Segment injiziert werden kann,f Verteilung ist im Vergleich zu dem Volumen der Verteilung der Injektion in den systemischen Kreislauf oder die Peritonealhöhle recht gering. Zusätzlich reduziert dieser Ansatz, wenn auch nicht beseitigt, was die Möglichkeit der systemischen Nebenwirkungen.
Diese Reihe von Experimenten gezeigt, dass die Injektion von PEG-SOD in die linken und mittleren zu einem signifikanten Abnahme führten Keulen in der Freisetzung von ALT, Lipidperoxidation der Zellmembranen (MDA) und die Wartung von Glutathion (GSH) im Vergleich mit den Kontrollen (Normal Saline ). Lebergewebe Transaminasen einschließlich Alanin-Aminotransferase (ALT) erfüllt sind Marker von hepatozellulären Verletzung. Die Verringerung der ALT, wenn der linke Lappen mit PEG-SOD injiziert wird, schlägt vor, eine schützende Wirkung von PEG-SOD. Erhöhte Gewebe MDA zeigt an Lipidperoxidation erhöht, und ist ein Marker für oxidativen Stress und Gewebeverletzung betrachtet. Die Überproduktion von reaktiven Sauerstoffspezies verursacht eine Erhöhung der Produktion von MDA 26. Die signifikante Reduktion der Gewebe MDA im Tiere links und mittleren Lappen, wenn sie mit PEG-SOD injiziert zeigt eine protektive Wirkung von PEG-SOD. Dies steht im Einklang mit dem aktuellen Verständnis, dass PEG-SOD Zellen vor Schäden schütztdurch teilweise reduzierte reaktive Sauerstoffspezies 27. Zusätzlich wird in der Gegenwart von reaktiver Sauerstoffspezies, Glutathion – Disulfid an Glutathion (GSH) 28 verringert. Die Wartung in GSH in den linken und mittleren Leberlappen mit PEG-SOD injizierten weiter verstärkt die schützende Wirkung von PEG-SOD. Außerdem wird gezeigt, dass es gespaltene Caspase-3 erhöht wird, ein Produkt von Apoptose, ausgesetzt in Gewebe Ischämie-Reperfusionsschaden. Die Abnahme der gespaltenen Caspase-3 in dem linken Lappens, wenn es mit PEG-SOD behandeln legt nahe, daß PEG-SOD zu einer Abnahme der Apoptose führt.
Superoxid-Dismutase (SOD) ist ein kritisches Enzym in der Detoxikation von reaktiver Sauerstoffspezies. Das Enzym katalysiert die Umwandlung von zwei Superoxidanionen zu Wasserstoffperoxid und Wasser. Das Enzym Katalase wandelt dann Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff, die Vollendung des Prozesses 25. Die Halbwertszeit vonnativer SOD beschränkt seine Verwendung in experimentellen Modellen, bis die Entwicklung von konjugierten Polyethylenglykol-Superoxid-Dismutase (PEG-SOD). Konjugation von SOD an Polyethylenglykol erhöht die Halbwertszeit von 6 min bis 14 h. Nguyen et al. seine Fähigkeit bewiesen Lipidperoxidation in hepatischer Ischämie in einem Rattenmodell, wobei die systemische Zufuhr 29 zu mildern.
Es gibt eine Vielzahl von möglichen Modifikationen der Technik hier detailliert und einige haben zuvor in der Literatur beschrieben worden. Je nach Modell verwendeten Molekülen geliefert wurde unter Verwendung von Inhalations 11, epidurale Infusion 12, intraperitoneale Injektion 17, 18, 21, 22, intravenöse Verabreichung 10, 14, 15 <sup>, 19, 23, 24 oder Injektion in die peripheren mesenterica superior 8.
Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll. Das wichtigste ist die Kanülierung der Pfortader. Es muss darauf geachtet werden, dass das Loch in der Vene schnitt nicht zu groß ist. Das Gewebe ist sehr elastisch und das Loch wird auf ihrem eigenen vergrößert. Wir empfehlen, beginnend durch ein Loch, das Schneiden von 0,5 mm mit der mikrochirurgischen Schere ist. Die Kanüle kann durch das Loch zugeführt werden, unter Verwendung eines Instruments, das für größere Flexibilität ermöglicht, als wenn dieser Teil des Verfahrens von Hand durchzuführen versucht. Zusätzlich können, während zunächst die Kanüle zugeführt wird, sollte es direkt in Richtung der Gabelung der linken und rechten Pfortader gerichtet werden, um zu vermeiden, dass ein Loch durch die Rückwand der Vene Stossen. Wenn die Kanülenspitze die Gabelung erreicht, kann es dann in die linke Vene zugeführt werden, um spezifischeVerbündete. Sobald die Kanüle in die linken Pfortader zugeführt wird, die sowohl die linke und mittlere Lappen liefert, kann seine Position manuell durch das Gefühl im Innern der Vene bestätigt werden. Seine Position kann auch durch Injektion eine kleine Menge kalten Salzes und zu sehen, die Abblassen Wirkung auf den mitgelieferten Segmenten der Leber bestätigt werden.
Die Leber hilar Clamp-Modell in der Ratte stellt eine reproduzierbare und stabile Plattform für hepatische ischämische Reperfusionsverletzung demonstriert. Variable hilar Klemm Modelle wurden von Forschern verwendet , um die schützende Wirkung von anti-Oxidantien zu studieren und andere kleine Moleküle , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14. Punkte Variations umfassen, die Schiffe sind Klemm ed, welches Segment ischämischen vorgenommen werden, ob oder ob nicht der Gallengang enthalten ist und die Länge des Zeitraums der Reperfusion 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Zusätzlich wird , wenn dieses Modell die Auswirkungen der Verabreichung eines Moleküls , dem Weg der Verabreichung zu untersuchen verwendet wird 8 auch heterogen ist, 10, 11,„> 12, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24. Es gibt mehrere Vorteile der beschriebenen Vorgehensweise. Erstens direkte Kanülierung des Portals Versorgung des ischämischen Segment ermöglicht die direkte segmentale hepatischen Lieferung die pharmakologische Substanz untersucht. Diese Nutzung der anderen Lappen der Leber als interne Kontrolle ermöglicht. Zweitens segmentale Leber Kanülierung für ein reduziertes Verteilungsvolumen für das Molekül untersucht werden kann. reduziert Dieser Ansatz, wodurch das Risiko von systemischen Nebenwirkungen wie direkt in die Leber interessierendes Segment. Direkte Kanülierung des hepatischen Segments ermöglicht die Substanz die Substanz injiziert, um vor-Ischämie geliefert werden, Intra-Ischämie oder post-Ischämie. Dies ermöglicht die Untersuchung der Wirkung des Moleküls an einer beliebigen Stelle in der Ischämie-Reperfusionsschaden Zyklus. Mit zunehmender Länge der ischämischen Zeit und erhöhte Verletzungs zusätzliche Möglichkeit zur Leberregeneration studieren würde zur Verfügung steht.
Es gibt auch einige Grenzen dieses Ansatzes. Die erste ist Anlaufkosten. Der Kauf eines Operationsmikroskop konnte eine deutliche Anlaufkosten für ein Labor sein, die nicht bereits eine besitzen. Diese Technik kann ohne Mikroskop schwierig oder unmöglich sein. Die zweite ist Lernkurve Zeit. Obwohl dieses Verfahren relativ einfach ist, dauert es einige Übung erfordern und es ist wahrscheinlich, dass ein Anfänger eine beträchtliche Anzahl von Verfahren erfordert ein Experte zu werden.
Zusammenfassend ermöglicht dieses Modell für eine reproduzierbare, einfache und kostengünstige Plattform Leberischämie-Reperfusionsschaden zu studieren. Obwohl in dem hier beschriebenen Protokoll Polyethylen glycol-Superoxid – Dismutase, ein Radikalfänger 25, infundiert wurde, könnte dieses Modell verwendet werden , um eine Vielzahl von verschiedenen pharmakologischen Substanzen , um einzuzuflößen ihre Auswirkungen auf die I / R – Schaden in der Leber zu bewerten.
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten, dass Dennis Mathias für seine illustrative Arbeit anzuerkennen. Diese Arbeit wurde durch die NIH T32AI 106704-01A1 und T. Flesch Fonds für Organtransplantation, Perfusion, Ingenieurwesen und Regeneration an der Ohio State University unterstützt.
Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 200- 250 grams | |
Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
Isoflurane Molecular Weight 184.5 | Piramal Healthcare | ||
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
Oxygen | Praxair | 98015 | |
27-0 Micro-Cannula | Braintree Scientific | MC-28 | |
Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
Polyethylene Glycol – Superoxide Dismutase (PEG-SOD) | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
GenieTouch | Kent Scientific | ||
Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
4×4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
Microsurgical Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
Forceps – Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
Forceps – Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
Scissors – non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
Forceps – Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
Other Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Mosquito Clamps | Generic | ||
Analysis | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alannine aminotransferase (ALT) assay | Biovision | K752-100 | |
Malondialdehye (MDA) assay | Abcam | ab118970 | |
Glutathione (GSH) assay | Cayman Chemical | 7030002 | |
Antibodies – Cleaved Caspase-3 and Actin | Cell Signaling Tecnology | Antibody 9661 | |
ImageJ Software | National Institutes of Health | ||
RIPA Lysis and Extraction Buffer | Millipore | 10-188 |