Introduction
Los mecanismos por los que el intestino regula el procesamiento de lípidos de la dieta, el hígado controles complejos síntesis de lípidos y metabolismo de las lipoproteínas, y cómo estos órganos trabajan con el sistema nervioso central para controlar la ingesta de alimentos se conocen por completo. Es de interés biomédico para dilucidar esta biología a la luz de la actual epidemia de la obesidad, las enfermedades cardiovasculares, la diabetes y la enfermedad de hígado graso no alcohólica. Los estudios en cultivos celulares y en ratones han proporcionado la mayor parte de nuestra comprensión de las relaciones mecánicas entre lípidos de la dieta y la enfermedad, y el pez cebra (Danio rerio) están emergiendo como un modelo ideal para complementar este trabajo.
El pez cebra tiene gastrointestinal similar (GI) los órganos, el metabolismo de los lípidos, y el transporte de lipoproteínas de vertebrados superiores a 1,2, se desarrollan rápidamente y son genéticamente manejable. La claridad óptica de la larvas de pez cebra facilita los estudios in vivo, una particulaventaja r para el estudio del sistema GI como su medio extracelular (es decir, la bilis, microbiota, la señalización endocrina) es prácticamente imposible de modelo ex vivo. De acuerdo, un cuerpo de investigación combinando la tratabilidad genética y condiciones favorables para imágenes en directo de las larvas de pez cebra con una variedad de manipulaciones de la dieta (alto contenido de grasa, 3,4 -colesterol 5 y dietas -carbohydrate 6,7), y modelos de enfermedad cardiovascular 8, la diabetes 9,10, esteatosis hepática 11-13, 14-16 y la obesidad, están emergiendo para proporcionar una gran cantidad de puntos de vista metabólico.
Un aspecto esencial de la transición de la larvas de pez cebra en la investigación metabólica es la optimización de las técnicas desarrolladas en otros animales modelo al pez cebra y el desarrollo de nuevos ensayos que explotan las ventajas únicas de la pez cebra. Este protocolo presenta técnicas desarrollados y optimizados para alimentar larvas de pez cebra un lipid-rica comida, visualizar el procesamiento de lípidos de la dieta de todo el cuerpo de la resolución subcelular, y miden la ingesta de alimentos. yema de huevo de pollo fue elegido para componer la comida rica en lípidos, ya que contiene altos niveles de grasas y colesterol (lípidos componen ~ 58% de yema de huevo de gallina, de los cuales ~ 5% es el colesterol, 60% son triglicéridos, y 35% son fosfolípidos ). Yema de huevo de pollo proporciona más grasa que los alimentos típicos comerciales de pez cebra de microgránulos (~ 15% de lípidos) y la ventaja de que es un alimento estandarizado con porcentajes conocidos de especies ácidos grasos específicos, como las dietas de pez cebra y regimientos de alimentación no se han normalizado a través de los laboratorios 17. Por otra parte, los análogos de lípidos fluorescentes previstos en la yema de huevo visualizar el transporte y la acumulación de lípidos de la dieta 18, los componentes celulares de imagen incluyendo gotitas de lípidos, actuando ambos colorantes vitales 3 y a través de la incorporación covalente en lípidos complejos, investigar el metabolismo a través de cromatografía en capa fina (TLC) 19 20.
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Protocol
Estos protocolos han sido aprobados por la Institución Carnegie para la Ciencia Institucional Cuidado de Animales y el empleo (Protocolo nº. 139).
1. Preparación de los animales
- Mantener los adultos y las larvas a 28 ° C en un 14 h: 10 h luz: oscuridad ciclo. Alimentar a los adultos dos veces al día con la cáscara de Artemia libre (decapsulated, no eclosión, a partir de las 14 dpf) y microgránulos comerciales.
- Estos protocolos se han optimizado para el uso de 6-7 larvas dpf recogida por desove natural del fondo AB. Los protocolos pueden ser modificados para las larvas de otras edades y procedencias. No proveer alimento exógeno antes del 6 dpf.
- Anestesie larvas con tricaína en medios embrión (EM) (4,2 ml de 4 mg / ml por tricaína 100 EM ml) a temperatura ambiente (RT).
2. Preparación de los lípidos ricos en yema de huevo RSS
- Preparar y almacenar las yemas de huevo de gallina. Separar la yema y la clara de 12 huevos de gallina. Reunir las yemas, alícuota de 1 ml en 1,5tubos ml y se almacena a -80 ° C hasta 1 año (12 yemas harán ~ 80 alícuotas). Aunar los blancos, almacenar y usar como, alimentación rica en proteínas pobre en lípidos.
- Preparar análogo de lípido fluorescente (s) que se añade a la alimentación de la yema de huevo, si se desea.
- Suspender el análogo comprado, polvo fluorescente de lípidos en etanol al 100% o 100% de cloroformo a 0,1 g / l (ver nota siguiente discusión de disolventes), la alícuota en tubos de vidrio opaco, sellar con parafilm, y almacenar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Debido a la rápida evaporación de los disolventes orgánicos no utilice volúmenes alícuotas de menos de ~ 400 l para el almacenamiento a largo plazo.
Nota: Si el análogo de lípido se suspende en etanol, grandes volúmenes de análogo de lípido serán utilizados, ya que se seca más rápido bajo N 2 de cloroformo. Si el análogo de lípido se suspendió en etanol que no tiene que ser secado y resuspendido antes de añadir a la alimentación de liposomas en el paso 2.2.4, pero la concentración total de etanol no debe superar 0.1% en el pienso de liposomas para evitar efectos fisiológicos de confusión potenciales de etanol. - Para los análogos de ácidos grasos fluorescentes: Preparar un volumen total de la emulsión de yema de huevo 20 ml 5% en EM. A partir de ese preparar alícuotas de 5 ml con una concentración final de 6,4 M de 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indaceno (BODIPY C 16) para los ensayos de formación de imágenes confocal en vivo y la ingesta de alimentos o 1 mg / ml BODIPY C 12 para obtener imágenes de microscopio estereoscópico. La transferencia de la cantidad deseada del análogo de lípido fluorescente en un tubo de plástico de 1,5 ml. Se seca el lípido bajo una corriente de N2, teniendo cuidado de no soplar el lípido fuera del tubo.
- Inmediatamente, se vuelve a suspender en 5 l de etanol 100% con la pipeta una corriente abajo de los lados del tubo, añadir 95 l EM, y mezclar bien.
Nota: La mezcla debe aparecer homogénea; Si los lípidos de color permanece en los lados del tubo o el líquido aparece clumpy, el lípido no ha solubilizado completamente y requiere más etanol. Proteger el tubo de aquí para allám de luz y almacenar en hielo. - Por análogo fluorescente de colesterol: preparar una concentración final de colesterol / ml 2,4 g de emulsión de yema de huevo 5 ml de 0,5-5% para los estudios de imagen en vivo. La transferencia de la cantidad deseada de colesterol en un tubo de plástico 1,5 ml. Se seca el lípido bajo una corriente de N2, teniendo cuidado de no soplar el lípido fuera del tubo.
- Inmediatamente, se resuspende en 15 l de RT 100% de etanol pipeteando una corriente abajo de los lados del tubo y se mezcla con 85 l de RT 1% graso libre de ácido BSA en H purificada 2 O. Proteger el tubo de la luz y almacenar en hielo.
- Suspender el análogo comprado, polvo fluorescente de lípidos en etanol al 100% o 100% de cloroformo a 0,1 g / l (ver nota siguiente discusión de disolventes), la alícuota en tubos de vidrio opaco, sellar con parafilm, y almacenar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Debido a la rápida evaporación de los disolventes orgánicos no utilice volúmenes alícuotas de menos de ~ 400 l para el almacenamiento a largo plazo.
- Preparar la yema de huevo de liposomas RSS.
- Añadir una alícuota descongelada de yema de huevo para EM en un tubo cónico de 50 ml. Agite la mezcla de yema de huevo diluida durante 1-2 minutos; la mezcla debe parece ser una emulsión homogénea.
- Se vierte la mezcla a través de un colador de malla fina para eliminar los conglomerados de proteínas y recoger en un nuevo tubo cónico, fresca 50 ml.
- sonica pulsote La mezcla de huevo con una micropunta cónico un cuarto de pulgada (5 veces (5 x 1 segundo encendido y 1 segundo apagado) una pausa 5-10 segundos entre cada serie; intensidad de salida: 6 W) a temperatura ambiente para crear liposomas. la configuración de energía Sonicator son instrumento dependiente y por lo tanto requieren de optimización para cada instrumento y micropunta.
Nota: Continuamente roca mezcla de liposomas a TA para mantener la homogeneidad hasta su uso.
- Añadir el análogo de lípido fluorescente a los liposomas de yema de huevo, si se desea. Inmediatamente después de la sonicación, pipetear las lípidos preparados en la mezcla de liposomas y agitar a alta velocidad durante 30 segundos para incorporar en liposomas. Proteger a la mezcla de la luz envolviendo el tubo en aluminio y continúe meciendo a TA.
Paradigma 3. Alimentación
- Preparar las larvas para alimentarse.
- Antes de comenzar la alimentación, las larvas a detectar los defectos morfológicos evidentes que pueden impedir la alimentación. larvas de transferencia de 60 mm x 15 mm o placas de Petri de 6 ó 12 pocillos plates, reducir al mínimo EM, y reemplazar con 5 ml de la solución de liposomas preparados.
- Si es necesario, transferir las larvas de control sin alimentar a 5 ml EM y / o 5 ml 5% de clara de huevo en EM y tratar en paralelo.
- Agite suavemente las larvas se incuban en un eje de balancín (29-31 ° C a 30 rpm) en el pienso para estimular la ingesta de alimentos sin dejar de proteger de la luz, si los análogos de lípidos fluorescentes están presentes. Si la necesidad larvas que se expone a la luz, minimizar la exposición con una cubierta de cristal tintado incubadora.
- Al final del período de alimentación, enjuague las larvas nadando libremente en EM 3 veces.
Nota: Las larvas pueden comenzar a consumir liposomas en cualquier momento durante la alimentación. Si es crítico que las larvas de comenzar la alimentación al mismo tiempo, la pantalla de la ingesta de alimentos (ver 3.4) después de 1 h de alimentación y devolver sólo larvas que han comenzado la alimentación de la emulsión de la yema de huevo para completar la alimentación. - Detectar las larvas en este punto de la ingesta de alimentos como un número pequeño no puede eat (generalmente 0-5 ~%). Examinar los intestinos de las larvas que han sido anestesiados o ligeramente enfriados en un bloque de metal en hielo para determinar si se han alimentado: larvas que han consumido liposomas tendrá un intestino oscuro (Figura 1).
- Image o proceso de larvas para la ingesta de alimentos inmediatamente. Alternativamente, el lugar larvas en EM fresco y se incuba a 28 ° C para permitir el procesamiento metabólico que se produzca.
4. Montaje Las larvas de imágenes en vivo
- Preparar el medio de montaje.
- El 3% de celulosa de metilo: añadir 0,75 g de metilcelulosa a 25 ml de casi ebullición EM, vórtice, roca a TA 2-3 días hasta que se disuelva por completo, y se almacena a 4 ° C durante años a -20 ° C. Los ciclos repetidos de congelación y descongelación a 4 ° C se eliminar las burbujas de aire. Almacenar 3% de metilcelulosa en hielo durante el montaje larvas.
- El 1,2% de agarosa de bajo montaje: añadir 0,3 g de bajo punto de fusión de agarosa a 25 ml y disolver EM llevando a ebullición, alícuota de 2 ml en tUBE, y se mantiene a 26-28 ° C en un bloque de calor. alícuotas no utilizados se pueden almacenar a temperatura ambiente o -20 ° C y se hirvieron otra vez en el momento de uso. Asegúrese de que agarosa es lo suficientemente frío antes de exponer a las larvas o pueden ser sobre-calentado.
- De bajo magnificación, imágenes en vivo de mediano rendimiento, colocar una lámina de vidrio sobre un tejido en un bloque de metal en hielo y esperar a que la corredera se enfríe. Aplicar una cantidad generosa de 3% de metilcelulosa (que se ha mantenido a 4 ° C en hielo) sobre el portaobjetos, transferir una larva en el metilcelulosa al 3%, usando un hierro pesca con sedal de pesca de diámetro (0,41 mm pegado a la extremo de un tubo capilar de vidrio) crear un troth para drenar el exceso EM (lo que no se diluirá que la celulosa de metilo) y la posición de las larvas como deseado.
- Para corto plazo (<20 min), de alta magnificación de imágenes en vivo con un objetivo de inmersión de aceite en posición vertical, montaje larvas con el cubreobjetos cobertizo método.
- Utilice pegamento a base de cianoacrilato (superglue) aadjuntar aa 22 mm x 30 mm cubreobjetos a un extremo de un portaobjetos de vidrio. Utilice una de póquer para poner una línea fina de 3% de metilcelulosa en la diapositiva al lado del cubreobjetos y transferir las larvas a la diapositiva con un gran calibre pipeta Pasteur. Eliminar el exceso de EM para que no se diluya la metilcelulosa.
- El uso de un poker, coloque suavemente larvas en la celulosa de metilo en sus lados (lado izquierdo hasta la imagen más del hígado, el lado derecho hasta la imagen de la vesícula biliar) con la cabeza junto a la cubreobjetos.
- superglue lugar en las esquinas de un segundo cubreobjetos y suavemente coloque un borde del cubreobjetos sobre el portaobjetos montado y el otro en la diapositiva, la reducción de las larvas. Tenga cuidado de no aplicar una presión excesiva durante esta etapa o con el objetivo mientras que las imágenes de manera que las larvas permanecerá ileso.
- Para largo plazo, de imágenes de alta magnificación con un objetivo de inmersión en posición vertical, montaje larvas en agarosa. Añadir una larva de una pequeña alícuota de 1,2% de agarosa de baja fusión y luego transferir lalarva en un pequeño volumen de agarosa a una placa de Petri.
- posición de forma rápida las larvas con un poker antes de que solidifique de agarosa. Dejar que la agarosa se seque durante 2-3 min y cubrir la agarosa plenamente con EM fresco para evitar que se seque.
- Para largo plazo, de imágenes de alta magnificación con un objetivo invertido, montaje larvas en un plato con fondo de vidrio en agarosa.
- Enfriar un bloque de metal en hielo. Coloque el plato en el bloque de metal separadas por un pañuelo de papel para evitar un enfriamiento excesivo y la congelación de las larvas. Transferir una larva al plato y quitar la EM por efecto de mecha con un pañuelo de papel.
- Coloque una gota de 28 ° C de agarosa de bajo punto de fusión (1,2%) en la parte superior de la larva y colocar inmediatamente con un póquer (lado izquierdo hacia abajo para mejor imagen del hígado, lado derecho hacia abajo a la imagen de la vesícula biliar). Retirar el recipiente del bloque frío, dejar secar durante 2-3 minutos, y añadir un volumen suficiente de EM fresca para cubrir la agarosa (~ 2-5 ml).
La ingesta 5. La comidaEnsayo
- Al final de un canal de liposomas yema de huevo que contiene 6,4 M BODIPY C 16, en común un mínimo de 10 larvas de lavado en un tubo de plástico 1,5 o 2 ml, eliminar EM, y complemento de congelación. Las muestras pueden ser almacenadas a -80 ° C protegido de la luz durante varios meses.
Nota: Si es posible, recoger múltiples repeticiones. Es importante para recoger larvas sin alimentar en este paso para normalizar la fluorescencia de fondo de lípidos (idealmente larvas de la misma embrague se utilizan). - Realizar una extracción de lípidos Bligh-Dyer modificada 3,21.
- Añadir 100 l tampón de homogeneización (20 mM Tris-Cl, EDTA 1 mM) a la muestra en hielo (H 2 O, alternativamente purificada se puede utilizar). Homogeneizar en hielo con un aparato de ultrasonidos micropunta (5 s en total: 1 seg en 1 segundo apagado). Compruebe que las larvas son totalmente homogeneizada; en caso contrario, repetir. Transferir a un tubo de cultivo de vidrio desechable de 13 ml (otros tubos de vidrio pueden ser utilizados).
Nota: El cloroformo es peligrosa; realizar todos los ex lípidos subsecuentepasos de tracción a temperatura ambiente en una campana química. - Por cada 100 l de tampón de homogeneización de segunda mano, añadir 375 l de 1: 2 (cloroformo: metanol). Vortex 30-60 seg, incubar 10 min, añadir 125 l de cloroformo por cada 100 l tampón de homogeneización utilizado, y agitar 30 seg.
- Añadir 125 l de 200 mM Tris pH 7,5 por 100 l tampón de homogeneización utilizado, vórtice 30 segundos y centrifugar (2.000 x g, 5 min, RT, protegido de la luz). Retirar con cuidado las muestras de la centrífuga. Ellos se pueden separar en dos fases: una fase superior es acuosa, una interfaz de escombros de las larvas, y una fase orgánica inferior (contiene lípidos).
- Con una pipeta de vidrio limpio recoger la parte inferior, la fase orgánica y la transfiere en un tubo de vidrio 13 ml limpio.
Nota: Tenga cuidado de evitar la fase acuosa y restos de larvas en la interfase; si se produce contaminación, repita el paso centrifugación y recoleta. Desechar la fase acuosa superior; puede ser útil para eliminar y desechar estefase antes de la recogida de la fase orgánica. La muestra puede ser almacenada a -80 ° C por hasta 1 mes. - Se seca la fase orgánica bajo vacío (0,12 atm) mientras que la protección de la luz. No continúe para secar las muestras después de que el líquido se haya evaporado, ya que reducirá la solubilidad en lípidos. Volver a suspender los lípidos en 2: 1 (cloroformo: metanol) y almacenar en hielo. El volumen óptimo del cloroformo: metanol solución depende del método de detección utilizado; empezar con poco y continuar para diluir según sea necesario. Una pauta general es utilizar 10 l de 10 larvas agrupada.
- Añadir 100 l tampón de homogeneización (20 mM Tris-Cl, EDTA 1 mM) a la muestra en hielo (H 2 O, alternativamente purificada se puede utilizar). Homogeneizar en hielo con un aparato de ultrasonidos micropunta (5 s en total: 1 seg en 1 segundo apagado). Compruebe que las larvas son totalmente homogeneizada; en caso contrario, repetir. Transferir a un tubo de cultivo de vidrio desechable de 13 ml (otros tubos de vidrio pueden ser utilizados).
- Encuentra las volúmenes completos de muestras en intervalos uniformemente espaciados sobre una placa de TLC canalizado y escanear la placa con un escáner de láser que se utiliza habitualmente para formación de imágenes biomolecular (por ejemplo, un lector de placas fluorescente). Para los análogos de lípidos fluorescentes incluidos en la lista de materiales que tienen un máximos de excitación 500 a 650 nm y emisión máximos de 510 a 665 nm, usar un láser de 488 nm y con la colección de emisión a 520 nm.
- Cuantificar el total de fluorescencia de cada punto con el software de imágenes.
Nota: para la correcta forma natural de lípidos de fluorescencia de fondo restando la fluorescencia de las muestras de larvas pareadas, sin alimentar.
- Cuantificar el total de fluorescencia de cada punto con el software de imágenes.
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Representative Results
Cuando se alimenta en un agitador a 29-31 ° C, la mayoría de las larvas sanas (≥95%) va a comer dentro de 1 hora. Al consumir la emulsión de yema de huevo, el intestino de las larvas se oscurece. Muy intestinos oscuros pueden ser observadas a las 2 horas (Figura 1). Si las larvas son sin comer o dejar de comer, el intestino sigue siendo clara. Las larvas alimentadas huevo blanco exhibición distendido lumen intestinal que no se oscurece en color.
Figura 1:. Screening Las larvas de la ingesta de alimentos de tipo salvaje larvas de 6 dpf fueron alimentados con 5% de yema de huevo en EM durante 2 horas o tratadas de forma paralela en EM para obtener los controles sin alimentar. sin alimentar larvas tienen intestinos claros, mientras que las larvas alimentadas que han consumido yema de huevo tiene intestinos oscuros cuando fotografiado en 10 veces en un estereoscopio. Las barras de escala representan 0,1 mm.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La alimentación con análogos de lípidos fluorescentes permite la visualización de transporte y acumulación sistémica subcelular de lípidos de la dieta. La señal fluorescente está presente a través de los órganos digestivos (intestino, hígado y páncreas) de las larvas alimentadas 5% de yema de huevo con 6,4 M fluorescente C 16 analógico para 8 hr montado con el cubreobjetos cobertizo método y la imagen con un objetivo en posición vertical (Figura 2) 3.
Figura 2:. Lípidos fluorescentes análogos de lípidos de la dieta Visualizar Transporte Representante imagen compuesta de una larva de 6 dpf (cabeza mirando hacia la derecha) alimentó 5% de yema de huevo en la EM con 6,4 M BODIPY FL 16 C durante 8 horas. Las larvas se montó en el 3% de celulosa de metilo por el cubreobjetos cobertizo método y fotografiada con un montante 63X objetivo de inmersión en aceite en un solo fotón microscopio confocal con un láser de argón. Las barras de escala representan 20 micras. Hígado, L; intestino, I; páncreas, P, vesícula biliar, GB; reimpreso con el permiso del Dev Bio 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Varios análogos de lípido permitir la visualización de un conjunto único de estructuras celulares ya que se metabolizan diferencialmente en lípidos complejos (es decir, triglicéridos, ésteres de colesterol, fosfolípidos). Después de 4 - 8 horas alimenta, C fluorescente 16 y C 12 análogos de etiquetar las gotas de lípidos, FL C 5 etiquetas de las gotas de lípidos fluorescentes, conductos hepáticos y pancreáticos, membranas celulares y redes arteriales, y fluorescente C2 analógico etiquetas hepática y pancreática y celular membranas (Figura 3) 3.
ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figura 3:. Diferente lípidos fluorescentes análogos único de la etiqueta celulares Órganos imágenes compuestas representativos de las larvas alimentadas 5% de yema de huevo en la EM con 6,4 M BODIPY FL C 16, C 12, C 5, C o 2 para 4-8 horas (6 dpf) . C 16 analógico se observa en gotitas de lípidos (LD) de los enterocitos, C 12 y C 5 análogos en LD enterocito y el lumen intestinal, y C 2 análogo en el lumen intestinal. Las larvas se monta en el 3% de celulosa de metilo por el cubreobjetos cobertizo método y fotografiada con un montante 63X objetivo de inmersión en aceite en un solo fotón microscopio confocal con un láser de argón. Las barras de escala representan 20 micras. Reproducido con permiso de Modelos de Drogas Discov Hoy Dis 22._blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El ensayo de la ingesta de alimentos larval fue desarrollado para investigar mutaciones cómo genéticos, la sobreexpresión de genes transgénicos, y / o tratamiento exógeno afecta a la ingesta de alimentos larval. Las larvas se alimentaron con una comida rica en lípidos de pinchos con un análogo de lípido fluorescente para indicar la cantidad de alimento consumido. larvas Unfed se recogen en paralelo para normalizar la cantidad de fluorescencia de fondo presente en las larvas, el aumento de la sensibilidad a la que se puede detectar el análogo de lípido fluorescente. Este ensayo se utiliza para mostrar que la sobreexpresión de la apolipoproteína A-IVb.1 (apoA-IVb.1) disminuye la ingesta de alimentos. Anteriormente Tg (Hsp70: apoA-IVb.1: mCherry) sin alimentar larvas alimentadas 10% yema de huevo con 6,4 M fluorescente C16 analógica durante 4 horas a 7 dpf consume aproximadamente un 30% menos de lípidos que las larvas de tipo salvaje (Figura 4) 20.
Figura 4:. Ensayo de la ingesta de alimentos Representante de tipo salvaje (WT) y Tg (Hsp70: apoA-IVb.1: mCherry) (Tg) larvas fueron alimentadas 10% de yema de huevo de gallina con 6,4 M BODIPY FL C16 durante 4 horas (Fed) o tratadas en paralelo en EM (Espontánea). (A) Las larvas se agruparon (n = 10), se extrajeron los lípidos, y los extractos fueron vistos en una placa de TLC. (B) la fluorescencia total se cuantificó, expresada en unidades arbitrarias fluorescentes (afu), normalizadas para la fluorescencia de fondo en los hermanos no alimentadas por sustracción, y se expresó en relación con WT. Larvas Tg que sobreexpresan la ApoA-IVb.1 ingerir menos análogos de lípidos marcados con fluorescencia, como se muestra por comparación con el WT (emparejado prueba t de Student, p <0,001; n = 9, 20 larvas por experimento). El cuadro representa a los 25-75 º percentiles, y la mediana se indica. Los bigotes muestran los 10-90 º percentiles. Reproducidocon el permiso de Dis Modelo Mech 20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las técnicas descritas aquí permiten a los investigadores tratan larvas de pez cebra con una alimentación rica en lípidos, visualizar el procesamiento de los lípidos de la dieta en larvas vivas, y cuantificar la ingesta de alimentos de las larvas. Para asegurar el éxito, se debe prestar especial atención a varios pasos críticos. huevos de gallina comerciales varían; para minimizar la variabilidad potencial llevamos a cabo todos los ensayos en los huevos orgánicos de gallinas libres de jaulas que no han sido enriquecidas con ácidos grasos omega-3. Las tasas de alimentación más bajas pueden ser observadas en los peces menores de 6 dpf con el resto de los suministros energéticos endógenos de yema, pescado, insalubres o pescado con mutaciones de desarrollo que impiden la ingesta de alimentos (es decir, la mandíbula o malformación del intestino, incapacidad para nadar correctamente). El laboratorio realiza generalmente Farber estudios de alimentación en 6-7 días después de la fertilización (DPF) porque las larvas no requieren alimentación exógena hasta que sus tiendas de yema endógenos se han agotado y el agotamiento de la yema permite una mejor visualización del sistema digestivo. Alimentacióna TA también reduce en gran medida el número de larvas que se alimentan. El incumplimiento de las larvas de pantalla para la ingesta de alimentos y la inclusión involuntaria de larvas no alimentadas en experimentos posteriores pueden confundir los resultados. Además, es importante proteger a los análogos de lípidos fluorescentes, y todas las muestras de las larvas alimentadas con los análogos, de la luz cuando sea posible para mantener la máxima fluorescencia, y la sensibilidad de este modo de ensayo. Por último, si se mide la ingesta de alimentos, no permiten la alimentación y persecución (el metabolismo período posterior a la alimentación) que excedan de un total de 4 horas, ya que la comida comenzará a ser excretado. En la actualidad, la velocidad a la que se excretan la comida y los análogos de lípidos asociados fluorescente es desconocida, pero la fluorescencia puede persistir a lo largo del cuerpo de la larva durante al menos 2 días después de la alimentación (JPO y SAF datos no publicados).
Hay varias maneras de modificar y solucionar los protocolos para responder a las preguntas experimentales de interés. La alimentación rica en lípidos puede llevar a cabo durante diversos períodos de time: 1 hr proporcionará una pequeña comida, mientras que 4 hr llenará el intestino con una gran cantidad de lípido. Sin embargo, la alimentación de las larvas de más de 6 horas no se recomienda como la yema y la EM no están preparados en condiciones estériles y sobrecrecimiento bacteriano en la yema de huevo / emulsión blanca pueden confundir los resultados (es decir, aumento de la inflamación, alteración del perfil de la microbiota intestinal). Las larvas pueden ser examinado inmediatamente después de la alimentación para investigar los efectos agudos de la alimentación de las larvas inmovilizado por enfriamiento breve o anestesia comenzará rápidamente a alimentado de nuevo después de recalentamiento, pero la refrigeración es el método preferido de inmovilización como larvas pueden presentar vómitos tras la anestesia (SAF observación no publicada). Alternativamente, los períodos de persecución pueden llevarse a cabo después de la alimentación para permitir el transporte y el metabolismo de los lípidos de la dieta antes del estudio. Aunque los alimentos se llevan a cabo por lo general en solución de liposomas 5 ml, los canales se han realizado con éxito en volúmenes que varían de 1 a 20 ml. Varios concentracións de yema de huevo se puede utilizar para la alimentación de las larvas; el laboratorio Farber realiza rutinariamente experimentos con 5% de yema de huevo (1 yema de huevo ml añadido a 19 ml EM), 0,5% de yema de huevo, y 10% de yema de huevo.
Hay limitaciones potenciales de los análogos de lípidos fluorescentes que deben ser considerados. Al elegir un análogo de lípido fluorescente es importante considerar cómo el lípido se procesa fisiológicamente y donde el resto fluorescente se encuentra en la estructura química de los lípidos en la interpretación de los resultados. Por ejemplo, los triglicéridos se descomponen en ácidos grasos libres y glicerol, y ésteres de colesterol en colesterol y ácidos grasos libres, en el lumen intestinal antes de la absorción. Por lo tanto, si se proporciona un triglicérido o éster de colesterol análogo fluorescente en la dieta la fluorescencia observada en el cuerpo hará un seguimiento de los ácidos grasos, colesterol libre, o glicerol que el resto fluorescente se une a, y no el éster de triglicéridos o colesterol originales. diferente fluorescenanálogos at lípidos etiquetar estructuras celulares únicas, y este hecho debe tenerse en cuenta durante la selección 3. También de la nota, en comparación con el metabolismo de los ácidos grasos nativos, la adición de un resto BODIPY es aproximadamente equivalente a la adición de ~ 2-3 carbonos a la longitud de cadena de ácidos grasos (SAF datos no publicados).
Las técnicas descritas aquí representan avances significativos sobre los ensayos anteriores descritos en el campo. Estudios previos a la elaboración de este alimento yema de huevo de gallina, dos manuscritos detallado en el que se cargaron las larvas impulsado el huevo duro yema de 4,23. La técnica descrita aquí presenta la ventaja de que la yema de huevo no tiene que ser duro y en polvo antes de su uso y que la yema de huevo en polvo tiene una muy corta vida media debido a su oxidación rápida. yema de huevo líquido se puede preparar también como liposomas que aceptan fácilmente análogos de lípidos fluorescentes para la entrega de la dieta eficaz. Alternativamente, los lípidos radiomarcados se pueden utilizar para Invesgar metabolismo de los lípidos de la dieta y medir la ingesta de alimentos, pero los análogos de lípidos fluorescentes no presentan los riesgos de seguridad asociados con la radiactividad. Sin embargo, si los investigadores desean utilizar lípidos radiomarcados, el laboratorio Farber ha realizado estudios para verificar que los lípidos radiomarcados se pueden incorporar en, y alimentado con éxito con, liposomas 19. Los análogos de lípidos fluorescentes descritos aquí fueron elegidos porque muestran el metabolismo muy similares a los lípidos endógenos y radiomarcados, y eran lo suficientemente brillante para la formación de imágenes de baja y alta potencia.
Precediendo el desarrollo de esta técnica para alimentar a los análogos de lípidos fluorescentes para las larvas, no hay otros métodos disponibles para visualizar el transporte de lípidos de la dieta y la acumulación in vivo. La visualización directa de los análogos de lípidos fluorescentes puede proporcionar una ventaja sobre el uso de medidas indirectas de la fisiología, tales como los lípidos séricos. La medición precisa de la ingesta de alimentos larvas de pez cebra también fue un largo staNding reto en el campo. La única alternativa era paramecios cultura, etiquetarlos con el trazador fluorescente lipofílica 4- (4- (didecilamino) estiril) - N yoduro de -methylpyridinium (4-Di-10-ASP), permite que las larvas para alimentar y medir la fluorescencia de la zona de intra-abdominal con un lector de placas de 24. Por último, estas técnicas tienen la ventaja de ser aplicable tanto a las pantallas de mediano rendimiento (es decir, pantallas adelante genéticos de procesamiento de lípidos de la dieta), así como los estudios de imagen de gran aumento centrado (es decir, revertir, estudios genéticos hipótesis de tracción). En el futuro, estas técnicas se pueden aplicar a fenotipo y la pantalla diversos modelos de enfermedad metabólica y GI en el pez cebra.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Anesthesia for larval zebrafish |
| Chicken eggs | N/A | N/A | Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids |
| Ultrasonic processor 3000 sonicator | Misonix, Inc. | S-3000 | To make egg yolk liposomes |
| Sonabox acoustic enclosure | Misonix, Inc. | 432B | To make egg yolk liposomes |
| 1/8” tapered microtip | Misonix, Inc. | 419 | To make egg yolk liposomes |
| Amber vials (4 ml, glass) | National Scientific | 13-425 | Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa |
| Incu-Shaker Mini | Benchmark | 1222U12 | Incubated shaker for feeds |
| BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid) |
| BODIPY FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid) |
| TopFluor cholesterol | Avanti Polar Lipids Inc. | 810255 | Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol |
| Fatty acid-free BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G | For TopFluor cholesterol solubilization |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm |
| Low melt agarose | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Mounting media for live larval imaging; 22 x 30 |
| VWR microscope slides | VWR | 16004-422 | Mounting larvae for live imaging |
| Coverslips | Cover Glass | 12-544A | Mounting larvae for live imaging |
| Super glue | Loctite | LOC01-30379 | Mounting larvae for live imaging |
| FluoroDish (glass bottom dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness |
| Confocal microscope | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Microscope for high magnification live imaging |
| Stereoscope | Nikon | SM21500 | Microscope for low magnification live imaging |
| Glass culture tubes | Kimble | 73500-13100 | Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml) |
| Savant SpeedVac Plus | ThermoQuest | SC210A | Lipid extraction |
| Channeled TLC plates | Whatman Scientific | WC4855-821 | Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued |
| Channeled TLC plates | Analtech, Inc. | 66911 | Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GE Healthcare | 9410 | Fluorescent plate reader for food intake assay |
| ImageQuant software | GE Healthcare | 29000605 | Analysis of food intake assay |
| 5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets | Kimble | 63A53WT | Transfering larvae |
References
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