استخدام خرطوشة مرشح للترشيح المياه العينات واستخلاص الحمض النووي البيئي
Summary
We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Abstract
Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Introduction
يشير الحمض النووي البيئي (إدنا) في البيئات المائية على المواد الجينية الموجودة في عمود الماء. أثبتت الدراسات الحديثة فائدة ادنا للكشف عن الأسماك من البيئات المائية المختلفة، بما في ذلك البرك 1-3، 4-8 الأنهار والجداول 9، ومياه البحر 10-14. ركزت معظم هذه الدراسات على الكشف عن الأنواع واحدة أو عدد قليل الغازية 1،4-6،8،14 ونادرة أو مهددة 3،9، في حين حاولت بعض الدراسات التي أجريت مؤخرا كشف في وقت واحد من أنواع متعددة في المجتمعات الأسماك المحلية 7،9، 12،13،15 وmesocosms 11،12.
ويسمى هذا النهج الأخير "metabarcoding" ويستخدم إدنا metabarcoding واحدة أو عدة مجموعات من الاشعال PCR لcoamplify منطقة الجين عبر عينات متنوعة تصنيفيا. ويلي ذلك إعداد مكتبة مع الفهرسة وإضافة محول، ويتم تحليل المكتبات فهرستها من قبل الإنتاجية العالية التسلسل الموازيمنصة. مؤخرا ميا وآخرون. 12 وضعت الاشعال PCR عالمية لmetabarcoding إدنا من الأسماك (وتسمى "MiFish"). الاشعال MiFish تستهدف في منطقة التغير الزائد من الميتوكوندريا 12S الريباسي جين (163-185 بي بي)، الذي يحتوي على معلومات كافية لتحديد الأسماك لعائلة التصنيف، جنس والأنواع باستثناء بعض المتجانسات ترتبط ارتباطا وثيقا. مع استخدام تلك الاشعال في إدنا metabarcoding، ميا وآخرون. 12 الكشف عن أكثر من 230 نوعا البحرية شبه الاستوائية من الدبابات حوض السمك مع المعروفة تكوين الأنواع والشعاب المرجانية بالقرب من الحوض.
مع تحقيق بروتوكول metabarcoding لاستيعاب مياه البحر الطبيعية مع مستويات تركيز إدنا من أسماك مختلفة، لاحظنا أن الاشعال MiFish فشلت في بعض الأحيان إلى تضخيم المنطقة المستهدفة لإعداد مكتبة لاحق. واحد من الأسباب الأكثر احتمالا لهذا التضخيم PCR ناجحة هو عدم وجود كميات كافية من الشركة المصرية للاتصالاتmplate الحمض النووي الواردة في كميات صغيرة من الماء المصفى (أي 1-2 L). وعلى الرغم من تركيز إدنا من مجموعة تصنيفية معينة هو مجهول قبل التضخيم، والترشيح من كميات المياه الكبيرة (> 1-2 لتر) من شأنه أن يكون وسيلة بسيطة وفعالة لجمع أكثر إدنا من البيئات المائية مع وفرة الأسماك النادرة والكتلة الحيوية، مثل المحيطات المفتوحة وأعماق البحار النظم الإيكولوجية.
بالنسبة للمرشحات الألياف القرص المستخدمة تقليديا في عدد من البحوث إدنا الأسماك 16، خراطيش تصفية لديها ميزة على استيعاب كميات المياه الكبيرة قبل انسداد 17. في الواقع، أظهرت دراسة حديثة حجم كبير (> 20 L) الترشيح للعينات مياه البحر الساحلية باستخدام خراطيش تصفية 18. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تعبئتها بشكل فردي ومعقمة، ويمكن إجراء عدة خطوات سير العمل التجريبي في السكن التصفية، وبالتالي تقليل احتمال تعرضها للتلوث من المختبر 19. الأخيرالميزة الهامة لإدنا metabarcoding، والذي من مخاطر التلوث ما زال ضمن أكبر التجريبية تتحدى 20،21. على الرغم من هذه المزايا التقنية خراطيش مرشح، لم يتم استخدامه في الدراسات إدنا من الأسماك مع اثنين من الاستثناءات 8،15.
نحن هنا نقدم بروتوكول لترشيح من عينات المياه مع فلتر خرطوشة واستخراج إدنا من مرشح من دون الحاجة إلى قطع فتح الإسكان. ونحن نقدم أيضا اثنين من أنظمة تنقية المياه البديلة اعتمادا على كميات المياه (≤4 L أو> 4 L). لمقارنة أداء بروتوكول المطورة حديثا وبروتوكول يستخدم سابقا باستخدام فلتر الألياف الزجاجية في مجموعتنا البحثية 12،14،22،23، ونحن أداء إدنا metabarcoding تحليل مياه البحر من خزان ماء ضخم (7500 م 3 ) مع تركيبة الأنواع المعروفة، وعرض عدد من أنواع الكشف المستمدة من البروتوكولين كنتائج التمثيلية. هذا البروتوكول حكما تم وضعها لmetabarcoding إدنا من الأسماك، ولكن ينطبق أيضا على ادنا من الكائنات الحية الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
في العديد من الدراسات metabarcoding باستخدام العينات البيئية مثل المياه والتربة، والعلاج في مرحلة ما بعد الترشيح من خرطوشة الفلتر بشكل عام على النحو التالي 24،25: 1) قطع مفتوحة أو تكسير السكن مع الأدوات اليدوية (قطع الأنابيب أو كماشة)؛ 2) إزالة عامل التصفية من خرطوشة. و3) ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported as basic research by CREST from the Japan Science and Technology Agency (JST) and by grants from JSPS/MEXT KAKENHI (Number 26291083) and the Canon Foundation to M.M. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
| Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
| 1-L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
| 10-mL pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| 10-L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
| Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
| Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
| Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
| Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
| Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
| High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
| Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
| Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
| Manifold | As One | 2-258-01 | |
| Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
| Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
| Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
| Adaptor for a 15 mL conical tube | Kubota | 055-1280 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |
References
- Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584 (2013).
- Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868 (2012).
- Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
- Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
- Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
- Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316 (2013).
- Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
- Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
- Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520 (2013).
- Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732 (2012).
- Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
- Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088 (2015).
- Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
- Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a ‘snapshot’ of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786 (2016).
- Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
- Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA – a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
- Stewart, F. J., DeLong, E. E. . Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. 10, 187-218 (2013).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161 (2009).
- Smalla, K., Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. . Molecular Microbial Ecology Manual. , 13-22 (1995).
- Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA – An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
- Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383 (2015).
- Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
- Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
- Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
- Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
- Deiner, K., Walser, J. -. C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
- Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
- Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A., Micic, M. . Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples’Springer Protocols Handbooks. , 325-339 (2016).
- Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
- Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
- Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
- Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).
