Longitudinal<em> En Vivo</em> Obtención de imágenes de la vasculatura cerebral: Importancia de las enfermedades del sistema nervioso central
Summary
Este manuscrito describe un procedimiento para realizar un seguimiento de la remodelación de la vasculatura cerebral durante la acumulación de placa amiloide in vivo usando longitudinal microscopía de dos fotones. Una preparación-cráneo adelgazada permite la visualización de los tintes fluorescentes para evaluar la progresión del daño cerebrovascular en un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer.
Abstract
Remodelación de la vasculatura del cerebro es un rasgo común de las patologías cerebrales. In vivo técnicas de imagen son fundamentales para detectar la plasticidad cerebrovascular o daños que se produzcan las horas extraordinarias y en relación con la actividad neuronal o el flujo sanguíneo. In vivo microscopía de dos fotones permite el estudio de la plasticidad estructural y funcional de las grandes unidades celulares en el cerebro vivo. En particular, la preparación de ventana cráneo adelgazada permite la visualización de regiones corticales de interés (ROI) sin inducir inflamación significativa en el cerebro. sesiones de formación de imágenes repetitivas de ROI cortical son factibles, proporcionando la caracterización de características distintivas de la enfermedad con el tiempo durante la progresión de numerosas enfermedades del SNC. Esta técnica acceder a las estructuras pial dentro de 250 micras del cerebro se basa en la detección de sondas fluorescentes codificadas por marcadores celulares genéticos y / o colorantes vitales. Este último (por ejemplo, dextranos fluorescentes) se utilizan para mapear la Luminal compartimiento de las estructuras cerebrovasculares. Germane con el protocolo descrito en el presente documento es el uso de un marcador in vivo de depósitos de amiloide, metoxi-O4, para evaluar la enfermedad de Alzheimer progresión (AD). También se describe el tratamiento de la imagen posterior a la adquisición utilizado para realizar un seguimiento de los cambios vasculares y los depósitos amiloides. Aunque se centra actualmente en un modelo de AD, el protocolo descrito es relevante para otros trastornos del sistema nervioso central donde se producen cambios patológicos cerebrovasculares.
Introduction
La vasculatura del cerebro es una estructura multicelular, que está anatómicamente y funcionalmente acoplado a las neuronas. Una remodelación dinámica de los vasos se produce en todo el desarrollo del cerebro y durante la progresión de patologías del sistema nervioso central (CNS) 1,2. Es ampliamente aceptado que el daño cerebrovascular es una característica de varias enfermedades del sistema nervioso central, incluyendo la epilepsia, la enfermedad de Alzheimer (EA), lesión cerebral traumática y la encefalitis de 3,4. Por lo tanto, el seguimiento de los cambios cerebrovasculares en vivo se vuelve significativo cuando se modela enfermedades del SNC, desde el inicio y en fases crónicas. Como modificaciones cerebrovasculares ocurren a menudo en forma concomitante con el daño neuronal o plasticidad, la imagen de la neuro-vascular representa un punto de partida clave para descifrar SNC fisiopatología de la enfermedad.
Este protocolo describe un procedimiento basado en dos fotones longitudinal para realizar un seguimiento de la remodelación de la vasculatura cerebral en un modelo de ratón deAD, una patología progresiva caracterizada por defectos en los vasos cerebrovasculares calibre grandes y pequeñas, debido a la deposición de placas amiloidogénica 5-7. Este procedimiento permite la visualización de los depósitos de amiloide y el seguimiento de su posición y el crecimiento con respecto a la remodelación neurovascular durante todo el curso de la enfermedad. Colorantes fluorescentes vitales se inyectan antes de cada sesión de formación de imágenes para la visualización de las placas de amiloide y vasculatura cerebral en ratones transgénicos AD 8. Sesiones de formación de imágenes repetidas de un retorno de la inversión a través de una ventana cráneo transcraneal adelgazada es no invasivo y el método de elección para evaluar la remodelación neurovascular en el cerebro de ratón de estar 2,5,9,10.
En el procedimiento siguiente se describe el protocolo quirúrgico, adquisición y procesamiento de imágenes. La progresión temprana de la angiopatía amiloide cerebral (CAA) en su mayoría en general leptomeníngeo y arteriolas penetrantes se caracteriza.
Protocol
Representative Results
Discussion
La técnica y el cráneo abierto para microscopía in vivo de dos fotones ofrece la ventaja de las sesiones de formación de imágenes ilimitadas de grandes campos de imagen 13,14. Sin embargo, esta técnica también produce inflamación en la región de interés 14, a menudo incompatibles o impactar neuro-vascular 15 salidas lectura. Por el contrario, la técnica de cráneo transcraneal adelgazada no resulta en neuro-inflamación, lo que permite de imagen fiable de las estructu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer la Liga Francesa contra l'épilepsie (MA-L), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale de Grant AVENIR R12087FS (FJ), beca de la Universidad de Montpellier (FJ) y la subvención de la Federación para la Investigación sobre Le Cerveau (a NM). Reconocemos la asistencia técnica de Chrystel Lafont en el IPAM instalación de plataforma de núcleo formador de imágenes in vivo de Montpellier, en. Agradecemos también a María Vernov (Weill Cornell Medical College) para la corrección del manuscrito.
Materials
| methoxy-X04 | tocris | 4920 | use 10 mg/Kg |
| FITC-Dextran 70Kda | sigma | 46945 | use 100 mg/Kg |
| gelfoam/Bloxang | Bausch and Lomb | ||
| micorsurgical blade | surgistar | 6900 | must be sharp and not dented |
| povidone-iodine | betadine | antisceptic solution | |
| binocular stereomicroscope | olympus | SX10 | optimal image contrast is crucial for this procedure |
| 2-photon microscope | zeiss | Zeiss LSM 710mp | |
| fine scissors-toughcut | Fine science tools | 14058-09 | this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue |
References
- Harb, R., Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. In vivo imaging of cerebral microvascular plasticity from birth to death. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (1), 146-156 (2013).
- Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. Perturbed neural activity disrupts cerebral angiogenesis during a postnatal critical period. Nature. 505 (7483), 407-411 (2014).
- Masamoto, K., et al. Microvascular sprouting, extension, and creation of new capillary connections with adaptation of the neighboring astrocytes in adult mouse cortex under chronic hypoxia. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 325-331 (2014).
- Marchi, N., Lerner-Natoli, M. Cerebrovascular remodeling and epilepsy. Neuroscientist. 19 (3), 304-312 (2013).
- Giannoni, P., et al. Cerebrovascular pathology during the progression of experimental Alzheimer’s disease. Neurobiol Dis. 88, 107-117 (2016).
- Kimbrough, I. F., Robel, S., Roberson, E. D., Sontheimer, H. Vascular amyloidosis impairs the gliovascular unit in a mouse model of Alzheimer’s disease. Brain. 138 (Pt 12), 3716-3733 (2015).
- Herzig, M. C., et al. Abeta is targeted to the vasculature in a mouse model of hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis. Nat Neurosci. 7 (9), 954-960 (2004).
- Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer’s disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. J Neurosci. 26 (40), 10129-10140 (2006).
- Liston, C., et al. Circadian glucocorticoid oscillations promote learning-dependent synapse formation and maintenance. Nat Neurosci. 16 (6), 698-705 (2013).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).
- Klunk, W. E., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J Neuropathol Exp Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Anim (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Cao, V. Y., et al. In vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons. J Vis Exp. (71), (2013).
- Holtmaat, A., et al. Long term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J Vis Exp. (43), (2010).
- Joseph-Mathurin, N., et al. Amyloid beta immunization worsens iron deposits in the choroid plexus and cerebral microbleeds. Neurobiol Aging. 34 (11), 2613-2622 (2013).
- Sadowski, M., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J Neuropathol Exp Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
