كتلة الأنسجة لتحديد تنكس عصبي في<em> ذبابة الفاكهة</em
Summary
يستخدم على نطاق واسع ذبابة الفاكهة كنظام نموذج لدراسة التنكس العصبي. يصف هذا البروتوكول الطريقة التي انحطاط، على النحو الذي يحدده تكوين فجوة في الدماغ، يمكن قياسها كميا. أنها تقلل أيضا الآثار الناجمة عن إجراء التجارب عن طريق تجهيز والسيطرة باجتزاء والذباب التجريبية كما عينة واحدة.
Abstract
أمراض الاعصاب التقدمية مثل مرض الزهايمر (م) أو مرض باركنسون (PD) هي تهديدا متزايدا لصحة الإنسان في جميع أنحاء العالم. على الرغم من أن نماذج الثدييات قدمت معلومات هامة في الآليات الكامنة وراء المرضية، ومدى تعقيد نظم الثدييات جنبا إلى جنب مع التكاليف الباهظة تحد استخدامها. لذلك، يوفر بسيطة ولكنها راسخة ذبابة الفاكهة نموذج نظام بديل عن التحقيق في المسارات الجزيئية التي تتأثر في هذه الأمراض. إلى جانب العجز السلوكية، وتتميز الأمراض العصبية التي كتبها الظواهر النسيجية مثل موت الخلايا العصبية وaxonopathy. لتحديد انحطاط الخلايا العصبية وتحديد كيف يتأثر بعوامل وراثية وبيئية، ونحن نستخدم منهج النسيجي التي تقوم على قياس الفجوات في العقول ذبابة الكبار. للحد من آثار خطأ منهجي ومقارنة مباشرة مقاطع من السيطرة وإكسبالذباب erimental في إعداد واحد، ونحن نستخدم طريقة "طوق" للأقسام البارافين. ثم يتم تقييم التنكس العصبي عن طريق قياس حجم و / أو عدد من الفجوات التي وضعت في الدماغ ذبابة. يمكن أن يتم ذلك إما من خلال التركيز على منطقة محددة من الفائدة أو من خلال تحليل الدماغ بأكمله من خلال الحصول على الأجزاء المتسلسلة التي تغطي الرأس الكامل. لذلك، هذا الأسلوب يسمح احد لقياس ليس فقط انحطاط شديد ولكن أيضا الظواهر خفيفة نسبيا ويمكن كشفها إلا في بعض الأقسام، كما يحدث أثناء الشيخوخة الطبيعية.
Introduction
مع زيادة في متوسط العمر المتوقع، وأصبحت الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر أو الشلل الرعاش تهديد الصحية المتزايدة للسكان عموما. ووفقا لمعاهد الصحة القومية، و 115 مليون شخص في جميع أنحاء العالم وتوقع أن تتأثر الخرف في عام 2050. وعلى الرغم من إحراز تقدم كبير في تحديد الجينات وعوامل المخاطر التي ينطوي عليها بعض على الأقل من هذه الأمراض، وبالنسبة للكثيرين منهم، والكامنة الآليات الجزيئية لا تزال غير معروفة أو غير مفهومة جيدا.
بسيطة الكائنات نموذج اللافقارية مثل انواع معينة ايليجانس وذبابة الفاكهة توفر مجموعة متنوعة من المزايا التجريبية لدراسة آليات الأمراض العصبية، بما في ذلك دورة حياة قصيرة، عدد كبير من ذرية، وتوافر وسائل الوراثية والجزيئية راسخة وفريدة من نوعها في بعض الأحيان 1 -12. وعلاوة على ذلك، هذه الكائنات قابلة للمنحازةشاشات التفاعل التي يمكن أن تحدد العوامل التي تسهم في هذه الأمراض آثار المشددة أو تخفيف على الظواهر العصبية.
تحليل هذه التفاعلات الوراثية وتقييم آثار الشيخوخة يتطلب بروتوكولات الكمي للكشف عن التنكس العصبي وقياس شدتها. ويمكن أن يتم هذا التقييم بسهولة نسبيا عند قياس الجوانب السلوكية في ذبابة الفاكهة، مثل التعلم حاسة الشم، انجذاب بالجاذبية السلبية، أو انجذاب ضوئي سريع، والتي توفر قيمة الأداء رقمية 13-21. ومن الممكن أيضا لتحديد الآثار المترتبة على بقاء الخلايا العصبية عن طريق عد الخلايا العصبية. ومع ذلك، وهذا ممكن فقط عندما تركز على مجموعة سكانية محددة يمكن تحديده بوضوح، مثل الخلايا العصبية الدوبامين التي تتأثر في PD، وحتى ذلك الحين، كانت النتائج مثيرة للجدل 22-24.
بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم أسلوب طوق لأداء مسلسل أقسام البارافين، طريقةالتي وضعت أصلا من قبل هايزنبرغ وBöhl، الذي يستخدم لعزل المسوخ الدماغ التشريحية في ذبابة الفاكهة 25. وفيما بعد تم تكييفها استخدام طريقة طوق، بما في ذلك في cryosections، vibratome أقسام، والأقسام البلاستيك 26-28. هنا، يتم توظيف هذه الطريقة للحصول على أقسام المسلسل من رئيس الطيران بأكمله، والتي يمكن استخدامها لقياس الفجوات التي تنمي في الذباب مع الظواهر العصبية 16،21،29-32. هذه القياسات يمكن القيام به في مناطق محددة في الدماغ أو يمكن أن تغطي الدماغ بأكمله؛ هذا النهج الأخير يسمح احد لتحديد حتى ضعف الظواهر التنكسية، كما لوحظ أثناء الشيخوخة. وأخيرا، عند استخدام الياقات، وتصل إلى 20 الذباب يمكن معالجتها على النحو إعداد واحدة، وهي ليست فقط أقل، ولكنه يسمح أيضا لتحليل السيطرة والذباب التجريبية في إعداد نفسها، والتقليل من القطع الأثرية نظرا للتغيرات طفيفة في تستغرق وقتا طويلا الإعداد.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر طريقة وصفها وسيلة لقياس تنكس عصبي في الدماغ من ذبابة الفاكهة. في حين أساليب أخرى، مثل عد نوع خلية معينة، ويمكن استخدامها لتحديد التنكس العصبي، والاستفادة من هذه الطريقة هو أنه يمكن تطبيقها بشكل عام. عد الخلايا يتطلب أن هذه الخلايا يمكن التعرف بشكل موثوق سوا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants to D.K. from the Medical Research Foundation of Oregon and from NIH/NINDS (NS047663). E.S. was supported by a training grant from the NIH (T32AG023477).
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | |
| Collar | Genesee Scientific | TS 48-100 | We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A discription to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html |
| Rubber ice cube tray for embedding | Household store | The size can be made to fit by glueing in additional walls | |
| Crystallizing dish | Fisher Scientific company | 08-762-3 | |
| Ether | Fisher Scientific Company | E138-1 | |
| Ethanol | Decon Laboratories Inc. | 2701 | |
| Choloroform | Fisher Scientific Company | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific Company | A38-212 | |
| Methylbenzoate | Fisher Scientific Company | M205-500 | Distinct Odor |
| Use in fume hood | |||
| Low Melting Point Paraffin Wax | Fisher Scientific Company | T565 | Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath |
| Microtome | Leica Biosystems | Reichert Jung 2040 Autocut | |
| Microscope Slide | Fisher Scientific Company | 12-550D | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific Company | 12-545-M | |
| SafeClear | Fisher Scientific Company | 314-629 | Three different containers for washes |
| Vertical Staining Jar with Cover | Ted Pella Inc. | 432-1 | |
| Permount | Fisher Scientific Company | SP15-500 | |
| Poly-L-lysine Solution | Sigma Life Science | P8290-500 |
References
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer’s disease and other neurodegenerative diseases. Front Genet. 5, 279 (2014).
- Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annu Rev Neurosci. 26, 627-656 (2003).
- Calahorro, F., Ruiz-Rubio, M. Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson’s disease, Alzheimer’s disease and autism spectrum disorder. Invert Neurosci. 11, 73-83 (2011).
- Chen, X., Barclay, J. W., Burgoyne, R. D., Morgan, A. Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases. Chemistry Central Journal. 9, 65 (2015).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Modeling human neurodegenerative diseases in transgenic systems. Hum Genet. 131, 535-563 (2012).
- Jaiswal, M., Sandoval, H., Zhang, K., Bayat, V., Bellen, H. J. Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophila. Annu Rev Genet. 46, 371-396 (2012).
- Konsolaki, M. Fruitful research: drug target discovery for neurodegenerative diseases in Drosophila. Expert Opin Drug Discov. 8, 1503-1513 (2013).
- Kretzschmar, D. Neurodegenerative mutants in Drosophila: a means to identify genes and mechanisms involved in human diseases. Invert Neurosci. 5, 97-109 (2005).
- Kretzschmar, D., et al. Swiss cheese et allii, some of the first neurodegenerative mutants isolated in Drosophila. J Neurogenet. 23, 34-41 (2009).
- Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Exp Neurol. 250, 94-103 (2013).
- Prussing, K., Voigt, A., Schulz, J. B. Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer’s disease. Mol Neurodegener. 8, (2013).
- Wentzell, J., Kretzschmar, D. Alzheimer’s disease and tauopathy studies in flies and worms. Neurobiol Dis. 40, 21-28 (2010).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. , (2011).
- Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. J Vis Exp. , e50339 (2013).
- Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss-cheese (SWS), the Drosophila orthologue of Neuropathy Target Esterase, is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. , (2015).
- Iijima, K., et al. Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila. PLoS One. 3, e1703 (2008).
- Krishnan, N., et al. Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants. Neurobiol Dis. 45, 1129-1135 (2012).
- Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31, 541-549 (2015).
- Papanikolopoulou, K., Skoulakis, E. M. Temporally distinct phosphorylations differentiate Tau-dependent learning deficits and premature mortality in Drosophila. Hum Mol Genet. 24, 2065-2077 (2015).
- Ping, Y., et al. Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration, learning and motor deficits, and a shorter lifespan in an Alzheimer’s model. PLoS Genet. 11, e1005025 (2015).
- Sujkowski, A., Rainier, S., Fink, J. K., Wessells, R. J. Delayed Induction of Human NTE (PNPLA6) Rescues Neurodegeneration and Mobility Defects of Drosophila swiss cheese (sws) Mutants. PLoS One. 10, e0145356 (2015).
- Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Dis Model Mech. 4, 701-707 (2011).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson’s disease in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 24, 10993-10998 (2004).
- Navarro, J. A., et al. Analysis of dopaminergic neuronal dysfunction in genetic and toxin-induced models of Parkinson’s disease in Drosophila. J Neurochem. 131, 369-382 (2014).
- Heisenberg, M., Böhl, K. Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means. Zeitschrift für Naturforschung C. 34, 143 (1979).
- Han, P. L., Meller, V., Davis, R. L. The Drosophila brain revisited by enhancer detection. J Neurobiol. 31, 88-102 (1996).
- Lin, C. W., et al. Automated in situ brain imaging for mapping the Drosophila connectome. J Neurogenet. 29, 157-168 (2015).
- Strausfeld, N. J., Sinakevitch, I., Vilinsky, I. The mushroom bodies of Drosophila melanogaster: an immunocytological and golgi study of Kenyon cell organization in the calyces and lobes. Microsc Res Tech. 62, 151-169 (2003).
- Bettencourt da Cruz, A., Wentzell, J., Kretzschmar, D. Swiss Cheese, a protein involved in progressive neurodegeneration, acts as a noncanonical regulatory subunit for PKA-C3. J Neurosci. 28, 10885-10892 (2008).
- Bolkan, B. J., Kretzschmar, D. Loss of Tau results in defects in photoreceptor development and progressive neuronal degeneration in Drosophila. Dev Neurobiol. 74, 1210-1225 (2014).
- Cook, M., Mani, P., Wentzell, J. S., Kretzschmar, D. Increased RhoA prenylation in the loechrig (loe) mutant leads to progressive neurodegeneration. PLoS One. 7, e44440 (2012).
- Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
- Rasmuson, B., Green, M. M., Ewertson, G. QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSES OF EYE PIGMENTS AND PTERIDINES IN BACK-MUTATIONS OF THE MUTANT wa IN DROSOPHILA MELANOGASTER. Hereditas. 46, 635-650 (1960).
- Bettencourt da Cruz, A., et al. Disruption of the MAP1B-related protein FUTSCH leads to changes in the neuronal cytoskeleton, axonal transport defects, and progressive neurodegeneration in Drosophila. Mol Biol Cell. 16, 2433-2442 (2005).
- Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. J Neurosci. 17, 7425-7432 (1997).
- Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss cheese (SWS), the Drosophila orthologue of neuropathy target esterase (NTE), is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. 9, 283-294 (2016).
- Davis, M. Y., et al. Glucocerebrosidase Deficiency in Drosophila Results in alpha-Synuclein-Independent Protein Aggregation and Neurodegeneration. PLoS Genet. 12, e1005944 (2016).
- Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila. J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).
- Kretzschmar, D., et al. Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila. Glia. 49, 59-72 (2005).
- Li, Y., et al. A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).
