Messa Istologia per quantificare neurodegenerazione in<em> Drosophila</em

Summary

Drosophila è ampiamente usato come sistema modello per studiare neurodegenerazione. Questo protocollo descrive un metodo con cui la degenerazione, come determinato dalla formazione vacuolo nel cervello, può essere quantificato. Si riduce anche effetti dovuti alla procedura sperimentale di elaborazione e controllo sezionamento e mosche sperimentali come un campione.

Abstract

malattie neurodegenerative progressive come la malattia di Alzheimer (AD) o malattia di Parkinson (PD) è una crescente minaccia per la salute umana in tutto il mondo. Sebbene i modelli di mammiferi hanno fornito importanti informazioni sui meccanismi alla base della patogenicità, la complessità dei sistemi di mammiferi insieme con i loro alti costi stanno limitando il loro utilizzo. Pertanto, il semplice ma ben consolidata modello di sistema Drosophila fornisce un'alternativa per lo studio dei meccanismi molecolari che sono colpite in queste malattie. Oltre a deficit comportamentali, malattie neurodegenerative sono caratterizzate da fenotipi istologici come la morte neuronale e assonopatia. Per quantificare la degenerazione neuronale e per determinare come esso è influenzato da fattori genetici e ambientali, usiamo un approccio istologico che si basa sulla misurazione dei vacuoli nel cervello mosca adulta. Per ridurre al minimo gli effetti di errore sistematico e di confrontare direttamente le sezioni di controllo e expmosche erimental in una preparazione, si usa il metodo 'collare' per le sezioni di paraffina. Neurodegeneration viene valutata misurando la dimensione e / o il numero di vacuoli che si sono sviluppate nel cervello mosca. Questo può essere fatto sia concentrandosi su una specifica regione di interesse o analizzando l'intero cervello ottenendo sezioni seriali che attraversano la testa completa. Pertanto, questo metodo permette di misurare non solo la degenerazione grave, ma anche fenotipi relativamente lievi che sono rilevabili solo in alcune sezioni, come avviene durante il normale invecchiamento.

Introduction

Con l'aumento dell'aspettativa di vita, malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer o di Parkinson sono diventati una minaccia per la salute crescente per la popolazione generale. Secondo il National Institutes of Health, 115 milioni di persone nel mondo sono previsti per essere colpiti da demenza nel 2050. Anche se sono stati compiuti progressi significativi per identificare geni e fattori di rischio coinvolti in almeno alcune di queste malattie, per molti di loro, il sottostante meccanismi molecolari sono ancora sconosciuti o non ben compreso.

Semplici invertebrati organismi modello come Caenorhabditis elegans e Drosophila melanogaster offrono una varietà di vantaggi sperimentali per studiare i meccanismi di malattie neurodegenerative, tra cui un breve ciclo di vita, gran numero di discendenti, e la disponibilità di metodi ben consolidati e, a volte unici genetici e molecolari ^{1 -12.} Inoltre, questi organismi sono suscettibili di imparzialeschermi di interazione in grado di identificare i fattori che contribuiscono a queste malattie per i loro effetti aggravanti o Ameliorating sui fenotipi neurodegenerative.

Analizzando tali interazioni genetiche e valutare gli effetti dell'invecchiamento richiede protocolli quantitativi per rilevare neurodegenerazione e misurare la sua gravità. Questa valutazione può essere fatta in modo relativamente facile quando si misura aspetti comportamentali di Drosophila, quali l'apprendimento olfattivo, geotassi negativi, o fototassi veloce, che forniscono un valore numerico delle prestazioni ^13-21. È anche possibile determinare gli effetti sulla sopravvivenza neuronale contando neuroni. Tuttavia, questo è possibile solo quando concentrandosi su una specifica popolazione che è chiaramente identificabile, come i neuroni dopaminergici che sono interessati nel PD, e anche allora, i risultati sono stati controversi ^22-24.

Il protocollo qui descritto utilizza il metodo collare per eseguire sezioni seriali paraffina, un metodoche è stato originariamente sviluppato da Heisenberg e Böhl, che lo utilizzò per isolare i mutanti cerebrali anatomiche in Drosophila ^25. L'utilizzo del metodo collare è stato successivamente adattato, anche in criosezioni, vibratome sezioni e profilati in plastica ^26-28. Ecco, questo metodo viene utilizzato per ottenere sezioni seriali di tutta la testa mosca, che può quindi essere utilizzato per misurare i vacuoli che si sviluppano in mosche con fenotipi neurodegenerative ^16,21,29-32. Queste misurazioni possono essere eseguite in specifiche aree cerebrali o in grado di coprire l'intero cervello; il secondo approccio permette di identificare anche fenotipi degenerative deboli, come osservato durante l'invecchiamento. Infine, quando si utilizzano i collari, fino a 20 in linea può essere elaborato come una preparazione, che è non solo meno tempo, ma consente anche per l'analisi di controllo e mosche sperimentali nella stessa preparazione, minimizzando artefatti da lievi variazioni la preparazione.

Protocol

1. fissare la testina sui collari e inclusione in paraffina Nota: Tutte le fasi del processo di fissazione dovrebbe essere fatto in una cappa aspirante. Benzoato di metile, anche se non presentano un rischio per la salute, ha un odore molto distinta, che può essere schiacciante, se non gestita in una cappa aspirante. Prima anestetizzare le mosche, portare 50 mL di soluzione di Carnoy aggiungendo 15 ml di cloroformio e 5 ml di acido acetico glaciale a 30 ml di 99% di etanolo (non mescolare cloroformio…

Representative Results

Utilizzando i risultati metodo descritto in sezioni seriali colorati con l'occhio del pigmento 33 che comprendono l'intera testa mosca. Una parte di questo è mostrato in Figura 1B, dove le sezioni da una testa individuo sono mostrati dall'alto verso il basso. Le sezioni di diverse mosche sono visti da sinistra a destra in questo esempio. Per facilitare l'orientamento e l'identificazione delle mosche, una mosca senza occhi (Oculis sinus…

Discussion

Il metodo descritto fornisce un mezzo per quantificare neurodegenerazione nel cervello di Drosophila. Mentre altri metodi, come conteggio di un tipo di cellula specifico, possono essere utilizzati per identificare neurodegenerazione, il vantaggio di questo metodo è che può essere applicata più in generale. Contare le cellule richiede che queste cellule possono essere identificate in modo affidabile utilizzando un anticorpo specifico o l'espressione di un marcatore specifico per cellule, che non è sempre…

Materials

Name of the Reagent/Equipment	Company	Catalog Number
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A discription to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made to fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor
Use in fume hood
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath
Microtome	Leica Biosystems	Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide	Fisher Scientific Company	12-550D
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific Company	12-545-M
SafeClear	Fisher Scientific Company	314-629	Three different containers for washes
Vertical Staining Jar with Cover	Ted Pella Inc.	432-1
Permount	Fisher Scientific Company	SP15-500
Poly-L-lysine Solution	Sigma Life Science	P8290-500