Summary
Dit protocol maakt gebruik van zowel subunit co-expressie en postlysis subunit mengen voor een grondig onderzoek van recombinant proteasoom montage.
Abstract
Proteasomen worden gevonden in alle domeinen van het leven. Zij bieden de belangrijkste route voor intracellulaire eiwitafbraak in eukaryoten, hoewel hun assemblage wordt niet volledig begrepen. Alle proteasomen bevatten een structureel geconserveerd kerndeeltje (CP) of 20S proteasoom, die twee heptamere β subeenheid ringen tussen twee heptamere ringen α subeenheid. Archaea 20S proteasomen zijn compositorisch eenvoudiger in vergelijking met hun eukaryote tegenhangers, maar ze beiden delen een gemeenschappelijke vergadering mechanisme. Bijgevolg Archaea 20S proteasomen blijven belangrijke modellen voor eukaryote proteasoom montage zijn. Specifiek heeft recombinante expressie Archaea 20S proteasomen gekoppeld denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) veel belangrijke inzichten proteasoom biogenese opgeleverd. Hier bespreken we een manier te verbeteren op de gebruikelijke strategie van co-expressie van archaea proteasoom α en ß-subeenheden voorafgaand aan nondenaturing PAGE. We laten zien dat hoewel snel en efficiënt, een co-expressie aanpak alleen kan missen belangrijke assemblage tussenproducten. Bij het proteasoom, kan co-expressie geen detectie van de half-proteasoom, een tussenproduct dat een volledige α-ring en een volledige β-ring mogelijk. Echter, dit tussenproduct wordt gemakkelijk gedetecteerd via lysaat mengen. Wij stellen voor dat de combinatie van co-expressie met lysaat mengen een aanpak die is grondiger in het analyseren van de montage oplevert, maar toch blijft arbeid nonintensive. Deze benadering kan nuttig zijn voor het bestuderen van andere recombinante multiproteïnecomplexen zijn.
Introduction
Multiproteïnecomplexen uit te voeren tal van kritische cellulaire activiteiten 1. Voor veel van deze complexen, meer bekend over hun structuur en functie dan ongeveer 2,3 de montage. Het proteasoom is zo'n complex en wordt in alle domeinen van het leven. In eukaryoten, deze moleculaire machine is de kern van het ubiquitine / Proteasome System (UPS) en geeft de belangrijkste route van intracellulaire eiwitafbraak 4. De eukaryote proteasoom (aangeduid als 26S proteasoom) bestaat uit twee belangrijke subassemblages: a 20S proteasoom of kerndeeltje (CP) 5, die kunnen worden afgesloten aan één of beide einden door een 19S Regulatory Particle (RP) 6.
Het 20S proteasoom is een groot gecompartimenteerd protease. De quaternaire structuur absoluut geconserveerd in alle levensdomeinen en bestaat uit een stapel van vier zevenringen die twee soorten structureel verwante subeenheden, α; en P 5,7,8. In eukaryoten worden de twee buitenringen elk bestaande uit zeven verschillende α subeenheden en twee binnenringen elk bestaan uit zeven verschillende β subeenheden; proteolytische activiteit berust bij drie van de β subeenheden. Daarentegen worden de CP ringen archaea en bacteriën gewoonlijk samengesteld uit slechts één type α en één type β subunit. Archaea proteasomen hebben verstrekt een belangrijk model systeem om proteasoom assemblage studeren als gevolg van zowel hun compositorische eenvoud en het delen van een gemeenschappelijke vergadering mechanisme met hun eukaryote tegenhangers 9-13. Kortom, α subeenheden assembleren in α ringen eerste, die dienen als een stellage waarop ß-subeenheden assembleren. De resulterende half-proteasomen (α β 7 7) dimeriseren, wat tot volledig geassembleerd CP (α β 7 7 7 α β 7). Dimerisatie tijdens de propeptiden in over ß-subeenhedenautokatalytische worden verwijderd, waardoor de katalytische N-terminale threoninen. Het gebruik van proteasomen Archaea montage model houdt vaak gebruik van de productie van recombinante archaea proteasoom eiwitten in Escherichia coli. Dit is een waardevolle benadering omdat het stelt de subeenheden worden geproduceerd in verschillende combinaties, zowel WT en mutante versies in een gastheerorganisme dat zijn eigen proteasomen niet produceert.
Monitoring van de assemblage van multi-eiwitcomplexen biochemisch vereist enige vorm van fractionering methode die volledig gemonteerd complexen van assemblage tussenproducten en voorlopers scheidt. Vanwege de superieure oplossen capaciteit denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) gebleken bijzonder bruikbaar bij de fractionering van diverse grote multiproteïnecomplexen 14-17 zijn. De combinatie van recombinant archaea proteasoom productie en denaturerende PAGE is uitgegroeid tot een krachtige aanpak in dissecting proteasoom montage 9,11,12,18. De gebruikelijke wijze waarop deze benadering wordt toegepast (bijv. Via de co-expressie van recombinant α en β-subeenheden) een belangrijk nadeel. Vergadering reacties zijn coöperatieve en sterk afhankelijk van de concentratie 3. Aangezien de eiwitconcentratie in cellen is zeer hoog 19 vanwege uitgesloten volume-effecten, assemblage reacties verlopen in vivo snel. Daarom is het mogelijk om belangrijke assemblage tussenproducten missen als α en β subeenheden co-expressie gebracht.
Hier, we pleiten voor een gecombineerde aanpak in het onderzoek naar proteasoomafhankelijke assemblage het gebruik van recombinante Archaea proteasoom subunits. In deze benadering worden zowel co-expressie en lysaat mengmethoden gebruikt. De voormalige zorgt voor een snelle analyse van de montage, omdat co-expressie is minder arbeidsintensief. De laatste is afhankelijk van afzonderlijke expressie van α en β-subeenheden, gevolgd door mengen. Hoewel dit requires met enige moeite dan co-expressie is meer dan gecompenseerd door de mogelijkheid om tussenproducten die worden gemist tijdens co-expressie te detecteren. Samen kunnen deze twee methoden een vollediger beeld proteasoomafhankelijke samenstel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bacteriële expressie.
Noot: Expressieplasmiden die in deze studie worden in Tabel 1. Oplossingen, media en buffers die in deze studie worden in Tabel 2. Het klonen van Archaea proteasoom subunit genen en het genereren van expressieplasmiden worden elders beschreven 18,20. Kortom, voor recombinante plasmiden co-expressie van subeenheden gebruik van een bicistronisch operon strategie die helpt bij het verkrijgen van vergelijkbare expressieniveaus van individuele subeenheden 18,20. De uitdrukking onderstaande parameters werden empirisch bepaald optimaal voor de proteasoom subunits in deze studie zijn. Het kan nodig zijn om expressie te optimaliseren voor andere proteasoom mutanten voor proteasomen uit andere archeale species of andere recombinant eiwit complexen (zie discussie).
- Transformeer expressieplasmide belangstelling in chemisch competente E. coli BL21 (DE3) cellen.
- Voeg 1-2 pl plasmide (typisch 50 - 100 ng) om een hoeveelheid DE3 cellen die vers werden ontdooid op ijs en verder incuberen op ijs gedurende 20 min.
- Heat shock de cellen bij 42 ° C gedurende 45 s en de buis terug naar ijs additionl 2 min.
- Voeg 1 ml LB medium en incubeer bij 37 ° C onder schudden (150 rpm) gedurende 1 uur.
- Spread 100-200 pl van het transformatiemengsel op LB-kan-platen (platen met vast LB-medium, aangevuld met kanamycine (alle plasmiden die in deze studie coderen resistentie tegen dit antibioticum)). Incubeer de platen bij 37 ° C O / N.
- De volgende ochtend, het enten van een enkele kolonie van de LB-kan plaat in 3 ml vloeibare LB-kan media in een glazen buis cultuur. Incubeer bij 37 ° C onder schudden (150 rpm) gedurende ongeveer 2,5-3 uur, of totdat troebeling optreedt.
- Meet de optische dichtheid van de kweek bij 600 nm (OD 600) in een spectrofotometer. Verdun de cel cultusure met een geschikte hoeveelheid voorverwarmde LB-kan media om een OD 600 van 0,4 in een eindvolume van 6 ml. Hervatten schudden bij 37 ° C gedurende 40 minuten.
- Induceren eiwitexpressie in de vloeibare kweken door toevoegen van IPTG een voorraadoplossing om een eindconcentratie van 1 mM. Incubeer bij 37 ° C onder schudden (150 rpm) gedurende ongeveer 6-7 uur.
- Oogst bacteriële celculturen in hun geheel in 1,5 ml microcentrifugebuizen.
- Voeg 1,5 ml van een cultuur in microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 min.
- Verwijder het supernatant en voeg nog eens 1,5 ml van dezelfde cultuur aan de pellet. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 min.
- Herhaal stap 1.11 totdat de hele cultuur wordt geoogst in de microcentrifugebuis.
- Bewaar de geïnduceerde pellets bij -80 ° C tot lysis.
2. Bacteriële Lysis en Lysate mengen.
Notitie: (dat wil zeggen dat controleert of eiwit werd tot expressie gebracht en oplosbaar). Dus, we raden met inbegrip van TSP analyse in eerste instantie. Zodra een optimale protocol is bereikt voor een bepaalde subeenheid combinatie is TSP analyse niet strikt noodzakelijk en daarom wordt beschreven als optionele hieronder.
- Lysis van bacteriële cellen en bereiding van oplosbare fracties.
- Ontdooi de geïnduceerde cel pellet op ijs gedurende 5 minuten. Resuspendeer de pellet in 600 ui lysisbuffer.
- IncUbate de suspensie bij 30 ° C onder schudden (150 rpm) gedurende 30 min de totale ruwe lysaat te genereren.
Opmerking: de volgende stap en de subsectie die volgt zijn optioneel. - Verwijder de twee 25 pi porties van het totale ruwe lysaat in afzonderlijke 1,5 ml microcentrifugebuizen en uitvoeren van TSP analyse als volgt.
- Om één van de twee 25 pi aliquots, voeg 5X SDS sample buffer tot een eindconcentratie van 1X. Label de buis met "T" voor "de totale ruwe lysaat".
- Incubeer de "T" monster bij 100 ° C gedurende 5 minuten volledig eiwitten denatureren.
- Ondertussen neemt u de tweede 25 pi aliquot en centrifuge het op 10.000 x g gedurende 10 min. Verwijder voorzichtig de bovenstaande vloeistof zonder verstoring van de kleine pellet, en over te dragen aan een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis. Label deze nieuwe tube "S" voor "oplosbare fractie".
- Om de kleine pellet links behind in de vorige stap, voeg 25 ul lysisbuffer en vortex te mengen. Label deze buis "P" voor "pellet-fractie".
- Voeg 6 ul 5X SDS monsterbuffer de "S" en "P" buizen en incubeer bij 100 ° C zoals hierboven beschreven.
Opmerking: Als de monsters niet TSP die dag worden gebruikt om expressie te analyseren, kunnen deze worden ingevroren bij -20 ° C totdat het nodig is. Ontdooide, moeten ze opnieuw geïncubeerd bij 100 * C, zoals hierboven beschreven, onmiddellijk vóór het laden op 12% en / of 15% standaard SDS-PAGE gel.
- Terwijl de TSP analyse wordt uitgevoerd, centrifuge de resterende 550 pi van de totale ruwe lysaat bij 10.000 x g gedurende 10 min (of de gehele 600 ul van de totale ruwe lysaat als TSP analyse wordt niet uitgevoerd). Verzamel de bovenstaande vloeistof in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis. Dit is de oplosbare lysaat die wordt gebruikt voor zuivering.
- Lysaat mengen.
- Verricht lysis zoals beschreven in de stappen 2.1.1 en 2.1.2 hierboven.
- Meng 600 ui totaal ruw lysaat van bacteriën tot expressie de gewenste α-subeenheid met 600 gl totaal ruw lysaat van bacteriën tot expressie het gewenste β subeenheid. Incubeer bij 37 ºC met een trage schudden gedurende 30 min.
Opmerking: Het kan nodig zijn om incubatietijd optimaliseren om maximale assemblage tijdens lysaat mengen te bereiken (zie Discussie). De tijd en temperatuur die hier zijn optimaal voor de recombinante eiwitten in deze studie en elders werden 18 bepaald. - Centrifugeer de gemengde lysaat bij 10.000 xg gedurende 10 min oplosbare materiaal te scheiden van onoplosbare pellet. Breng de supernatant naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis. Gebruik deze gemengde oplosbare lysaat voor eiwitzuivering.
3. Protein Purification via geïmmobiliseerd Cobalt affiniteitshars(ICAR).
- Equilibreren de hars.
- Grondig mengen van de hars door het omkeren van het flesje en breng 50 pl van de suspensie naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 700 xg gedurende 2 minuten tot pellet hars. Zorgvuldig aspireren supernatant.
Let op: Wij voeren pipet aspiratie met behulp van een blauwe 1 ml pipet tip om het grootste deel van de vloeistof te verwijderen. Een wit 2 pi tip voor nauwkeurige controle van de verwijdering van het resterende supernatant, waardoor een zeer dunne vloeistoflaag die de korrels. - Voeg 1 ml buffer A. Meng zachtjes hars en resuspendeer centrifugeer bij 700 xg gedurende 2 minuten hars pellet. Zorgvuldig aspireren het supernatans en herhaal deze wasstap nog een keer.
- Grondig mengen van de hars door het omkeren van het flesje en breng 50 pl van de suspensie naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 700 xg gedurende 2 minuten tot pellet hars. Zorgvuldig aspireren supernatant.
- Solliciteer oplosbare lysaat eerder verkregen in paragraaf 2.1 of 2.2 op de geëquilibreerde hars. Incubeer de buis met zachte rotatie bij 4 ° C gedurende 60 minuten. Centrifugeer de buis bij 700 x g </ Em> voor 5 min en voorzichtig zuig het supernatant.
- Was de hars als volgt specifiek gebonden eiwitten te verwijderen.
- Resuspendeer hars met 1 ml buffer A en incubeer met zachte schommelen bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Centrifugeer de buis bij 700 xg gedurende 5 minuten en voorzichtig zuig de supernatant. Herhaal deze wasstap nog een keer.
- Resuspendeer hars met 1 ml buffer B (Buffer A met 5 mM imidazool) en incubeer onder zacht schommelen bij 4 ° C gedurende 5 min. Centrifugeer de buis bij 700 xg gedurende 5 minuten en voorzichtig zuig de supernatant. Herhaal deze wasstap nog een keer.
- Resuspendeer hars met 1 ml Buffer C (Buffer A met 10 mM imidazool) en incubeer onder zacht schommelen bij 4 ° C gedurende 5 min. Centrifugeer de buis bij 700 xg gedurende 5 minuten en voorzichtig zuig de supernatant.
- Elueer het eiwit door het toevoegen van 400 gl buffer E (buffer A met 200 mM imidazool) to de hars. Incubate met zachte schommelen bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Centrifugeer bij 700 xg gedurende 5 minuten.
- Transfer supernatant dat gezuiverd eiwit aan een nieuwe 1,5 ml centrifugebuis.
- Ontzouten het gezuiverde eiwit door seriële centrifugatie als volgt.
- Aan 400 pi van gezuiverd eiwit, voeg 100 ul buffer A (vermindert Imidazool concentratie van 200 mM tot 160 mM). Toepassen gezuiverd eiwit aan 0,5 ml ultracentrifugale filters met een 10 kDa moleculair gewicht cut-off. Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 5 minuten.
- Werp het filtraat en voeg 400 ul buffer A aan het retentaat en centrifugeer opnieuw verdunnen. Voortzetting van de cycli van centrifugeren / verdunning tot imidazol concentratie lager dan 4 mm. Als voorbeeld, indien elk centrifugeren concentreert 500 pi naar ~ 70 gl (of ongeveer 7 maal), waarna twee cycli de start 160 mM imidazool concentratie (7 x 7 = 49-voudig) verminderen approximately 3,3 mM.
- Meet de eiwitconcentratie van het monster ontzout met behulp van de BCA assay 21.
Noot: Het ontzouten moet imidazool beneden de tolerantiegrens voor de BCA assay verminderen, volgens de instructies van de fabrikant. Ons laboratorium voorkeur de BCA assay omdat het gevoelig is, heeft een groot dynamisch bereik, en vertoont minder eiwit tot eiwit variant. Echter, andere methoden om eiwitconcentratie bepaald worden gesubstitueerd voor de BCA assay. De sleutel is om de hoogte van de voordelen en beperkingen elke methode.
- Voeg 5X natieve monsterbuffer tot een uiteindelijke concentratie van 1x en ga aan elektroforese. Als alternatief, monsters bewaar bij -20 ° C voor latere analyse.
4. denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE).
Let op: Ongepolymeriseerd acrylamide is een neurotoxine. Draag geschikte beschermende gear.
- Bereid de denaturerende PAGE gel als volgt.
- Bereid de gel cassette voor het gieten van het gebruik van schone glazen platen en gieten stand. Plaats gradient maker op de top van een kleine magnetische roerder en plaats een kleine roerstaafje in elke kamer.
- Toepassing van 40% (w / v) acrylamide en 2% (w / v) bisacrylamide voorraadoplossingen, bereid 5% en 10% (w / v) acrylamidegel oplossingen in een natieve oplossing buffer. Zorgen dat de verhouding van totale acrylamide tot bisacrylamide is 37,5: 1. Chill op ijs voor het gieten.
Opmerking: Het denaturerende PAGE systeem hier gebruikt is in wezen identiek aan de Laemmli SDS-PAGE systeem met SDS 22 weggelaten. - Voeg Ammoniumpersulfaat (van een 10% (w / v) stockoplossing bereid in water) aan de acrylamide oplossingen voor polymerisatie te initiëren. Eindconcentratie ammoniumpersulfaat is 0,1% (w / v).
- Giet de acrylamide-oplossingen in de twee kamers van het verloop maker. Met de uitlaat buis gestoken between de platen van de gelcassette, activeert de magnetische roerder en het verloop maker kleppen openen. Giet de 5-10% denaturerende gradiënt gel.
- Eenmaal gegoten, bedekken de gel met een dunne laag Isopropanol en laat de gel polymeriseren 30 min. Gedurende deze tijd, voor te bereiden verse 5% acrylamide gel-oplossing in het oplossen van inheemse buffer. Na de gel sets, afgieten Isopropanol en spoel de bovenkant van de gel met gedeïoniseerd water uit een spuitfles.
- De 5% geloplossing hierboven bereide, voeg ammoniumpersulfaat (precies zoals beschreven in 4.1.3) en giet bovenop de gepolymeriseerde gel tot glasplaten vol. Plaats gel kam. Laat de overlay gel polymeriseren gedurende nog 30 min.
- Zodra gel is gepolymeriseerd, assembleren gel cassette in elektroforese apparaat. U kunt ook opslaan van de gel bij 4 ºC, verpakt in vochtige papieren handdoeken en plastic folie tot aan gebruik.
- Zodra denaturerende PAGE gel is gemonteerd in electrophoresis apparaten, vul de tank met 1X inheemse lopende buffer vers bereid uit een 10X inheemse lopende buffer voorraad.
- Load 10 ug gezuiverde eiwit, verkregen aan het einde van hoofdstuk 3, in elk putje met behulp van een glazen injectiespuit.
- Load 2 pi van gewicht natief eiwitstandaard hoog molecuulgewicht (verdund in 1X natieve loopbuffer) in één van de putjes.
- Run gel bij 55 V en 4 ºC totdat de kleurstof voorkant loopt uit de gel (ongeveer 4-4,5 uur).
- Naast de denaturerende gel analyse aliquots van de gezuiverde eiwit door middel van standaard SDS-PAGE 22.
- Meng monsters (10 ug) van het gezuiverde eiwit monsters, verkregen op het einde van hoofdstuk 3, met 5x SDS-monster buffer tot een uiteindelijke concentratie van 1X.
- Incubeer bij 100 ° C gedurende 5 minuten en plaats op standaard 12% en / of 15% SDS-PAGE-gels 22.
- Draaien op 80V gedurende 20 minuten en daarna tot de kleurstof voorkant van de gel (rent weg is dit bij 120 V ongeveer een addnele 75 min voor een 12% gel en 120 min voor een 15% gel).
5. Visualiseren activiteit en eiwit kleuring.
- Na elektroforese zorgvuldig gescheiden glasplaten en breng de denaturerende gel een gel lade met 50 ml gedeïoniseerd water. Spoel gel met zachte schommelen gedurende 5 minuten. Gooi water en herhaal deze wasstap drie keer.
- Voeren substraat overlay assay als volgt.
- Voeg 1 ml buffer die de ontwikkeling fluorogeen peptidesubstraat Suc-LLVY-AMC en gelijkmatig verdeeld over de gel. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
Opmerking: Een glazen staaf of gel releaser (klein stukje plastic gebruikt om afzonderlijke glasplaten) kan worden gebruikt om de vloeistof verdeeld over de gel. - Breng voorzichtig de gel op de UV transilluminator van de gel beeldvormingssysteem en acht fluorescentie vanwege de gesplitste peptidesubstraat. image Record. Breng voorzichtig de gel back om de gel lade.
- Spoel de gel tweemaal met 50 ml gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten onder voorzichtig schommelen.
- Vlekken op de gel met 10 ml van een colloïdale Coomassie kleuring reagens gedurende 60 minuten onder voorzichtig schommelen. Destain gel met 50 ml water, totdat de achtergrond duidelijk. Deze kleuring stap geldt voor de standaard SDS-PAGE gels ook.
- Voeg 1 ml buffer die de ontwikkeling fluorogeen peptidesubstraat Suc-LLVY-AMC en gelijkmatig verdeeld over de gel. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proteasoom samenstel (figuur 1) begint als a-subeenheden vormen samen ringen 9. Dit kan worden geïllustreerd als a-subeenheden van de archaeon Methanococcus maripaludis S2 zijn uitgedrukt in E. coli als C-terminaal hexahistidine tag (his-gemerkte) derivaten (Tabel 1). Wanneer het recombinant α-eiwit zijn gezuiverd door ICAR en geanalyseerd door denaturerende PAGE, werden twee banden waargenomen (Figuur 2A, laan 1). We hebben eerder aangetoond dat deze overeenkomen met Single α Rings (SR) en Double α-Rings (DR) 18. De DR is een doodlopende soort die niet productief voor de volgende vergadering 9,18.
Toen a-zijn subeenheden werden tezamen tot expressie gebracht met β subeenheden, wat neerkomt op de gebruikelijke wijze waarop assemblage van recombinant archaea proteasomen wordt getest, een nieuwe soort werd waargenomen migreren in de buurt van de 670 kDa grootte standard (Figuur 2A, laan 3). Deze soort was proteolytisch actief (Figuur 2B, baan 3) en bevatte alleen volledig volwassen β-subeenheden (mβ), waarvan de pro-peptiden zijn verwijderd (figuur 2C, baan 3). Deze soort is het volgroeid CP. Dit monster bevatte ook enkele SR soorten, die werd verwacht, omdat SR is een bekende samenstel intermediair, maar geen DR soorten. Het ontbreken van DR toen-a zijn en ß-subeenheden zijn co-expressie gebracht suggereert dat een correcte montage voorkwam snel genoeg zodanig dat opname van β subeenheden in staat was om de niet-productieve vorming van DR outcompete (voor een nadere analyse wordt verwezen 18).
De beperking van de co-expressie werkwijze demonstreren, en pleiten voor de bruikbaarheid van een gecombineerde benadering, α-zijn en ß-subeenheden werden afzonderlijk tot expressie gebracht in E. coli. Na lysis, de oplosbare fracties werden gemengd en eiwitten werden vóór gezuiverd door ICARanalyse door denaturerende PAGE. Volledig functionele proteasomen werden ook gegenereerd via het lysaat mengen benadering (figuur 2A en 2B, laan 2) en de SR species werd ook waargenomen zoals verwacht. De terugkeer van de DR soorten in het lysaat mengen steekproef geeft aan dat eenmaal gevormd, β subeenheden niet in staat zijn om reversibel demonteren; Dit onderstreept de doodlopende aard van de DR. Interessant is dat een nieuwe soort verscheen ook in het lysaat monster mengen, het migreren onder de CP (genaamd "half"). Onlangs hebben we aangetoond dat deze soort komt overeen met de halve proteasoom (a- 7 β 7) 18. Om dit te illustreren hier, een β subunit mutant (R166W) werd toegepast. Deze mutatie verstoort β-β ring interactie, wat leidt tot verminderde half-proteasomen dimerisatie 18. Sinds half-proteasomen zijn de directe voorlopers van CP, moet de R166W mutatie leiden tot zowel ophoping van half-proteasomen eenda afname van CP formatie. Wanneer lysaat mengen met α-en β zijn (R166W) subeenheden werd uitgevoerd, lagere CP en verhoogde niveaus van de "half" species waargenomen (Figuur 2A, laan 4). Dit komt overeen met een precursor-product relatie van deze twee banden, en bevestigt de identiteit van de "half" soort als de half-proteasoom. De iets snellere migratie van de half-proteasoom in de mutant monster (laan 4 versus laan 2) is waarschijnlijk het gevolg van de mutatie R166W wijziging van de massa-tot-lading verhouding van de β subunit.
De mogelijkheid om de half-proteasoom tijdens lysaat mengen zichtbaar is voornamelijk te wijten aan de veel lagere eiwitconcentraties in het lysaat in vergelijking tot de hoge eiwitconcentraties in cellen. Lagere concentraties leiden tot minder efficiënt (dwz langzamer) samenstel, welke tussenproducten stelt meer bevolkte en dus detecteerbaar geworden. Naast het uiterlijk van de half-proteasoom, een extra observatie wijst op de verminderde assemblage efficiency tijdens lysaat mixen: onverwerkte β-subeenheden, die hun pro-peptiden te behouden, worden aantoonbaar (proβ). Omdat propeptide verwerking pas optreedt half proteasomen dimeriseren, het uiterlijk van de onrijpe vorm proβ correleert met het niveau van half-proteasoom accumulatie (vergelijk Figuur 2C, baan 3 versus baan 2 versus laan 4). Bij de R166W mutant, het falen propeptide gegevens gedurende lysaat mengen absolute hoewel een kleine hoeveelheid CP vormt. Dit komt omdat propeptide verwerking vereist niet alleen half-proteasoom dimerisatie, maar ook een goed gevormde β-β ring-interface 23 die de R166W mutatie niet veroorloven. Een meer gedetailleerde verhaal van co-expressie versus lysaat mengen, als het gaat om recombinant proteasoom montage, kan hier worden 18 gevonden.
guur 1 "src =" / files / ftp_upload / 54860 / 54860fig1.jpg "/>
Figuur 1: Een vereenvoudigd schematisch van Core Particle (CP) Vergadering.
De α subeenheden kunnen assembleren tot een α-ring eerst (SR) dat dient als een matrijs voor de inbouw van β subeenheden. Dit leidt tot de vorming van de halve proteasoom tussenproduct (half) die snel dimeriseert. Gelijktijdig met dimerisatie, worden de β subeenheid propeptiden (niet getoond) verwijderd autokatalytische die tot het volledig functionele kerndeeltje (CP). Double α-ringen (DR) kan het gevolg zijn van SR en zijn niet bevoegd voor de montage in CP. Hun formatie staat voor een niet-productieve assemblage traject (gestippelde pijl) in tegenstelling tot productieve montage evenementen (vast pijlen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Een gecombineerde aanpak voor het bepalen Proteasome Vergadering.
Coëxpressie (C) en lysaat mengen (L) toegepast voor het samenvoegen van recombinant proteasomen bestuderen van de archaeon M. maripaludis. Eiwitten werden gezuiverd door middel van geïmmobiliseerd Cobalt Affinity Resin (ICAR). (A, B) Gezuiverde eiwitten (10 ug) werden op niet-denaturerende 5-10% gradiënt gelen. Na elektroforese werd peptidase activiteit zichtbaar gemaakt door het gel te bedekken met buffer oplossing die het fluorogene peptidesubstraat Suc-LLVY-AMC (B) voorafgaand aan de gel met colloïdale Coomassie-kleuring reagens (A) kleuring. Zwarte pijlpunten geven de posities van de geassembleerde 20S kerndeeltje (CP), half-proteasoom tussenproduct (halve), dubbele α-ring (DR) en één α-ring (SR). De migratie van verscheidene groottestandaarden moleculaire (in kDa) aangegeven rechts. (C) A werden aangebracht op 15% SDS-PAGE gels. Na elektroforese werden de gels gekleurd met colloïdaal Coomassie kleuring reagens. Migratie van α-subunit zijn en volgroeid (mβ) en onvolwassen (proβ) β subeenheden wordt aangegeven. De positie van de 25 kDa molecuulgewicht standaardmaat staat rechts. Asterisk geeft een afgeknotte α-subeenheid zijn fragment resulterend uit aspecifieke proteolyse tijdens lysis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| plasmide | Genotype | Bron |
| AKB191 | pET42 PSMA-zijn | Kuśmierczyk et al., (2011) |
| AKB464 | pET42 PSMA-zijn PSMB | Kuśmierczyk et al., (2011) |
| AKB946 | pET42 PSMB | Panfair et al., (2015) |
| AKB952 | pET42 PSMB (R166W) | Panfair et al., (2015) |
Tabel 1: plasmiden gebruikt in deze studie. PSMA is de Archaea α subunit gen en PSMB de Archaea β subeenheidgen.
| buffer A | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2. | Buffers B, C en E, derivaten van buffer A met Imidazool. Het is nuttig om imidazool uit een 2 M voorraadoplossing bereid in water en in het donker bewaard voegen. |
| Inheemse oplossen buffer | 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% (v / v) tetramethylethyleendiamine (TEMED) en 0,1% (w / v) Ammonium Perulfate (APS). | Geprepareerde niet meer dan een uur voor gel te polymeriseren en op ijs bewaard. Bij de voorbereiding acrylamidegel oplossingen in natieve buffer oplossing, is het nuttig om de Tris-HCl van 4X voorraad (1,5 M Tris-HCl, pH 8,8) toegevoegd. De APS wordt toegevoegd onmiddellijk voorafgaand aan polymerisatie. |
| Inheemse running buffer 10X voorraad | 250 mM Tris, 1,92 M glycine, pH niet. | |
| 5X inheemse monsterbuffer | 0,5 M Tris-HCl, pH 8,8, 50% (v / v) glycerol, sporen van broomfenolblauw. | Sporen verwijst naar een zeer kleine hoeveelheid, gewoonlijk een paar korrels overgedragen via spatel. |
| 5X SDS-monsterbuffer | 0,3 M Tris-HCl, pH 6,8, 600 mM dithiothreïtol (DTT), 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) glycerol en sporen broomfenolblauw. | Sporen verwijst naar een zeer kleine hoeveelheid, gewoonlijk een paar korrels overgedragen via spatel. |
| ontwikkelingsbuffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 1 mM ATP, 50 mM Suc-LLVY-AMC. | Suc-LLVY-AMC is een fluorogeen peptidesubstraat gebruikt proteasoom activiteitstest. |
Tabel 2: Solutions, Media en buffers gebruikt in deze studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We tonen het voordeel van een gecombineerde aanpak van het analyseren van proteasoom montage door denaturerende PAGE met behulp van recombinant Archaea proteasomen. De gebruikelijke methode 9,11 van bacteriële co-expressie van proteasoom subunits zorgt voor een snelle analyse, maar kan niet onthullen sleutel assemblage tussenproducten. We raden het combineren van co-expressie met lysaat mengen tot een breder beeld van de montage evenementen te ontwikkelen.
Het voordeel van deze gecombineerde benadering is dat ondanks gebruik van aparte expressie van de α en ß-subeenheden voor lysaat menging, nog relatief arbeidsintensief kinderen. De resultaten kunnen ook semikwantitatieve als men zorgt vergelijkbare en expressieniveaus van de afzonderlijke eiwitten. Daartoe aangeraden uitvoeren van de gebruikelijke optimalisatie van recombinant eiwitexpressie aan omstandigheden die vergelijkbare hoeveelheden tot expressie gebrachte eiwitten lysaat voorafgaand aan menging laten bepalen. Optimalisatie kan onder meer variëren inductie time, inductietemperatuur, optische dichtheid bij inductie, bacteriële expressie stam, enzovoorts, totdat de gewenste niveaus van oplosbaar eiwit worden bereikt. Dit is vooral van belang bij het vergelijken van WT en mutante versies van een proteïne omdat soms de mutant vergelijkbare expressieniveaus vertonen maar verminderde oplosbaarheid. We benadrukken het belang van het bepalen eiwitconcentraties van de ICAR-gezuiverde monsters voorafgaande aan het laden van de denaturerende PAGE. Zelfs met expressie optimalisatie plaats en van de beste op gelet dat parallelle monsters worden verwerkt via de zuiveringsstappen op dezelfde wijze variantie nog onbedoeld geïntroduceerd. Een concentratiemeting zodat dezelfde hoeveelheid totaal eiwit goed geladen per monster. Dit maakt lane-to-lane vergelijkingen van de band intensiteiten voor een bepaalde migrerende soorten meer betekenis.
Als vergelijkbare en niveaus van eiwitexpressie kan worden bereikt voor lysate mengen, kan men altijd zuiveren alle componenten van tevoren en het uitvoeren van het mengen van experimenten met pure eiwitten. Dit heeft het voordeel dat nauwkeuriger eiwitbepalingen vormt en derhalve de kwantitatieve benadering. Echter, het nadeel van volledige zuivering is dat het proces wordt aanzienlijk arbeidsintensiever, die snelle analyse van meervoudige mutanten tegelijkertijd 18 kan uitsluiten. Een laatste waarschuwing vermelden waard is dat soms scheiden expressie van α en ß-subeenheden wellicht niet mogelijk. Dit kan gebeuren als een mutatie veroorzaakt een subeenheid onoplosbaar in E. coli uitgedrukt over, maar laat oplosbaarheid worden herwonnen wanneer de mutant tot expressie wordt gebracht met zijn bindingpartner. Als dit gebeurt, zal het onderzoek alleen co-expressie te beperken. Dit is echter een waarschuwing dat kan tijdens recombinante eiwitexpressie in het algemeen en is niet specifiek voor Archaea proteasoom subunits 24,25.
We kozen ervoor om genErate his-tag derivaten van onze proteasomale eiwitten te wijten aan het gemak van de zuivering en de betaalbaarheid van de ICAR hars. Andere epitoop tags zijn mogelijk, waaronder die voor antilichamen gebaseerde zuivering en wij hebben met succes tot expressie gebracht en gezuiverd Flag-tagged versies van onze proteasoom subunits (niet getoond). Indien zuivering tot homogeniteit (of vergroten de productieschaal) vereist, zijn de gemerkte versies bieden de snelste en meest efficiënte manier om dit te doen.
Het is een gegeven dat de resultaten verkregen met recombinant eiwitten, zijn ze Archaea of eukaryotische eiwitten geproduceerd in bacteriën, zal verder krijgen betekenis wanneer opgevolgd met in vivo observaties. Echter, een in vivo benadering niet altijd direct bereikbaar zijn experimenteel. Dit geldt vooral wanneer het onderwerp van onderzoek is een groot, complex multisubeenheid zoals het proteasoom. Recombinant eiwit benaderingen een belangrijk startpunt voor future experimenten. Bij het proteasoom, koppelen recombinant Archaea proteasoom productie van denaturerende PAGE blijft zeer effectief ophelderen hoofdkenmerken van proteasoom samenstel, die gedeeld tussen archaea en eukaryotische soorten 9,11,12,18 zijn. Een dergelijke benadering is waarschijnlijk nuttig voor het bestuderen van het samenstel van andere grote multiproteïnecomplexen ook zijn. Onlangs, gebruikten we deze strategie aan te tonen dat Archaea proteasomen kunt samenvoegen via meer dan één pad, en dat α-ringen zijn niet de obligate tussenproducten tijdens de montage dat ze werden verondersteld te zijn 18. Er moet nog worden vastgesteld of de Hetzelfde geldt voor eukaryotische proteasomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund in het kader van een onderzoek fondsen ter ondersteuning van Grant (RSFG) van de Universiteit van Indiana-Purdue University, Indianapolis, en deels door een onderscheiding van de American Heart Association 14GRNT20390154, om ARK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear |
| Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E. coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized Cobalt Affinity Resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
- Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Williamson, J. R.
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
- Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
- Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
- Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
- Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W.
- Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
- Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
- Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
- Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
- Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
- Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130 (2015).
- Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
- Smith, P. K., et al.
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
- Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).
