Abstract
一氧化氮（NO）是在血管内平衡，并且也是神经递质主要调节分子之一。酶产生的NO是由各种含氧血红素蛋白等仍然不为人所熟知的途径相互作用氧化成亚硝酸盐和硝酸盐。相反的过程，还原硝酸盐和亚硝酸盐的成NO已经在哺乳动物中发现了在过去十年中，它是受到关注的可能的途径，以防止或减轻，被认为是心血管，代谢和肌肉疾病的整个范围中的一个与NO的水平降低有关。血液，体液及各种组织 - 它来估计在不同的身体区室NO及其代谢物的量是重要的。血，因为它容易获得，是用于NO代谢物的估计优选隔室。由于它的使用寿命短（几毫秒）和低次纳摩尔浓度，血液没有直接可靠的测量<EM>在体内存在很大的技术困难。因而NO可用性是根据其氧化产物，亚硝酸盐和硝酸盐的用量通常估计。这两种代谢物始终单独测量。有几种公认的方法来确定在生物体液和组织中的浓度。在这里，我们提出了一个协议，用于化学发光法（CL）的基础上，分别由三碘或三氯化钒的解决方案，亚硝酸盐或硝酸盐还原后分光光度检测NO的。对亚硝酸盐和硝酸盐的检测灵敏度低纳摩尔范围，这台CL作为目前最敏感的方法来确定NO代谢途径的变化。我们详细讲解了如何才能在收集，以及如何的时间来确定样品中相应的金额保留原始金额硝酸盐和亚硝酸盐存在的准备从生物体液和组织样本。在CL技术的局限性也是EXPlained。
Introduction
亚硝酸盐，并不太延长硝酸盐，血中水平反映机体的整体状态NO代谢。在血液亚硝酸盐的浓度和最器官和组织是仅在高纳摩尔或低微摩尔范围，硝酸盐通常存在高得多的量 - 在微摩尔范围内。在亚硝酸盐水平由于疾病进展变化或饮食习惯的改变是相当小的，并且可以使用一个非常敏感的方法只测定。由于它们非常不同等级和不同的代谢过程，硝酸盐和亚硝酸盐水平的单独的测定是必不可少的。所谓哪里硝酸盐和亚硝酸盐是在一起测量具有非常小的值“NO x的决心”。
关于各种生物样品中定量亚硝酸盐的几种方法已经被开发 - 最常见的是最老的，基于已在1879年即使现代改性中最初描述的格里斯反应NS，亚硝酸盐达到由格里斯'方法的灵敏度极限是低微摩尔范围内。化学发光（CL）与三碘化物还原溶液相结合，被认为是当前最敏感的方法，允许量化在亚硝酸盐的浓度1-8,10,11的低纳摩尔范围内。相同的CL的方法，用三氯化钒还原溶液相结合，可以用于硝酸盐敏感测量，精确在纳摩尔范围9。
CL检测游离气体NO。因此，亚硝酸盐，硝酸盐，R-亚硝基硫醇（R-SNO），R-亚硝胺（R-NNO），或金属-NO化合物（以后在手稿称作“R-（X）-NO”），必须将其转换成免费无气，以通过CL量化其原始金额。转化为NO是使用几种不同的减少解决方案来实现，这取决于NO代谢物的性质。转换后，游离NO的气体从反应容器中由载体气体（他，N-吹扫2或Ar）到CL分析仪的反应室，其中臭氧（O 3）与NO组合以形成二氧化氮（NO 2）在它的激活状态。与返回到基态，NO 2 *发射在红外线区域和发射的光子由CL仪的光电倍增管（PMT）来检测。发出的光的强度成正比的反应室的NO浓度，这允许使用适当的校准曲线原种的浓度的计算。
在我们的协议，我们硝酸盐和亚硝酸盐的第一本基于CL-测定中最常用的临床设置 - 在血液和血浆，然后我们将讨论如何确定组织样本中的这些离子。我们还详细解释如何保持在亚硝酸盐反应的环境中，如血液及其隔间，血浆和红血细胞的原始生理亚硝酸盐浓度。
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Protocol
所有协议，包括使用动物都是由NIDDK动物护理和使用委员会批准使用，并从美国国立卫生研究院血库健康供者获得人血。
1.样品制备
- 亚硝酸盐保存溶液的制备
- 制备含890毫铁氰化钾溶液（K 3的Fe（CN）6）和118毫NEM（N-乙基马来酰亚胺）在蒸馏水。充分溶解，直到很明显的黄色，没有晶体存在。 9比例（V / V，NP-40 /溶液）：在一个1添加的NP-40（辛基phenoxylpolyethoxylethanol）。轻轻混匀，避免起泡，并储存在4℃下一个星期左右）。
- 收集和制备的血液样品的
- 使用至少20G的针，以避免与肝素溶血防止凝血（5U / ml）的收集血液。用于全血样品，与亚硝酸盐在1立即保存液混合血液：4的比例（ⅴ/ v溶液/血）。
- 对于血浆和红血细胞的样品，离心在4℃下将收集的血液在4000 xg离心5分钟以分离红细胞（RBC）和血浆。取上清（血浆），并将其与上述用于测定血浆中的亚硝酸盐水平的所述亚硝酸盐保存液混合。
- 小心除去残留从管的底部的样本和吸移管红细胞样品的血浆和血沉棕黄层，以避免由其它类型的使用的截止枪头血细胞的污染，并转移到一个管含有在同一亚硝酸保存液比如上述。
- 混合各样品（血浆和红细胞）用冷甲醇在一个比为1：1或1：2（V / V样品/甲醇）和以13,000 xg离心离心他们在4℃15分钟以沉淀蛋白质。取上清，并使用它用于亚硝酸盐测量或冻结制备的样品，如果需要的话，在干冰上并储存在-80℃。
注：亚硝酸盐快速REA克拉与血液形成硝酸盐氧合血红蛋白（oxyHb）。因为oxyHb总是存在于大过量的亚硝酸盐，该反应导致具有的〜10分钟的时间帧天然血液亚硝酸盐的几乎完全湮没。为了保存最内源性血液亚硝酸盐，亚硝酸盐，防腐剂溶液在抽血后立即加入到全血样品。该解决方案将快速溶解红血细胞和氧化oxyHb成高铁血红蛋白（metHb），血红蛋白的无活性形式，不发生化学亚硝酸盐反应。
- 样品从其它类型的体液的制备
- 样品收集到适当的容器后，用亚硝酸盐保存液，deproteinate拌匀，即可测量或在-80℃冷冻和储存。
- 收集和制备的组织样本
- 从收集与肝素生理盐水（10U HEPA灌注动物组织RIN / ml）中。消费约1g所需的组织的，均质或者使用手动匀浆器或自动均化器。
- 添加亚硝酸盐根据需要实现平滑匀浆保存液的已知量。
- 如上所述（：1或1 2比V / V样品/甲醇1），以13,000 xg离心然后离心样品在4℃，15分钟一次组织匀浆化，用冷甲醇沉淀蛋白质。
- 收集上清和测量亚硝酸盐的含量。如果需要的话，在制备干冰和存储的任何阶段冷冻样品在-80℃下。
2.减少溶液的制备
- 三碘（I 3）减少亚硝酸盐和R-（X）-NO种决心1,3,4解决方案
- 用138在水中毫I 2溶液一起制备301毫碘化钾的溶液。 7比上约30分钟，直到所有的磁力搅拌器（体积/体积溶液/乙酸）：在2冰醋酸混合晶体溶解。最好是保持在黑暗瓶，碘化物对光敏感，并准备在一周内使用。
注意：此解决方案将减少亚硝酸盐成NO，它也将自R-SNO，R-NNO和Fe-NO官能团（R-（X）-NO）释放NO，但硝酸也不会受到影响。从上面的基于无官能基的信号可以从真亚硝酸信号通过用酸化的磺胺（AS）和进行比较的AS-处理和未处理的信号的样本的一半隔开。 AS不可逆地形成重氮阳离子与亚硝酸并且不能由我3溶液可以减少这种复杂。对于AS处理，制备磺胺290毫溶液在1M HCl和它在比1添加到样品的等分试样：9（V / V AS /样品）。测量在样品的AS-处理和未处理部分CL信号。计算真实的亚硝酸盐的信号作为样本的AS-处理的和未处理部分的差。亚硝酸盐可以通过使用选择性尼特可以还测定RITE还原为部分2.2描述抗坏血酸/乙酸混合物溶液。但是，由于R-（X）-NO品种目前的通常少量使用AS-未经处理的样品测量是在大多数情况下，总的亚硝酸盐含量的一个很好的近似。
- 用138在水中毫I 2溶液一起制备301毫碘化钾的溶液。 7比上约30分钟，直到所有的磁力搅拌器（体积/体积溶液/乙酸）：在2冰醋酸混合晶体溶解。最好是保持在黑暗瓶，碘化物对光敏感，并准备在一周内使用。
- 抗坏血酸/乙酸（4A）为亚硝酸盐2的选择性测定溶液
- 制备在水中的500mM抗坏血酸。混合用冰醋酸该溶液在一个比为1：7（体积/体积，抗坏血酸/乙酸）中以制备反应混合物。
注意：此溶液是具体的亚硝酸盐，不会从任何R-（X）-NO物种或硝酸盐释放NO。然而，抗坏血酸和醋酸的溶液必须被新鲜的测量之前每天制备，如抗坏血酸容易在溶液中氧化。
亚硝酸盐还原的完成取决于抗坏血酸的浓度;并建议完全r至少为50 mm抗坏血酸血浆中的亚硝酸盐排出。然而，建议与最终样品测量之前对不同浓度的抗坏血酸和亚硝酸盐的标准在预期亚硝酸浓度范围执行一些预试验。请记住，抗坏血酸在测量过程中略有消耗，建议在玻璃反应室的反应混合物如此频繁的变化。
- 制备在水中的500mM抗坏血酸。混合用冰醋酸该溶液在一个比为1：7（体积/体积，抗坏血酸/乙酸）中以制备反应混合物。
- 钒（III）硝酸盐测定氯9减少解决方案
- 制备的VCl 3的1 M盐酸51毫溶液。通过200微米的过滤器和储存在一个黑暗的瓶过滤器解决方案，在两个星期内使用。
注意：此解决方案将减少硝酸盐，亚硝酸盐和所有R-（X）-NO物种，因此，如果比较的量的亚硝酸盐或其它R-（X）的-NO物种存在与硝酸一起，最终硝酸盐内容来计算与的VCl 3和I中得到的CL信号之间的差3降低了解决方案。
- 制备的VCl 3的1 M盐酸51毫溶液。通过200微米的过滤器和储存在一个黑暗的瓶过滤器解决方案，在两个星期内使用。
3.化学发光（CL）分析仪的安装和测量
- 标准的解决方案
- 制备的亚硝酸钠1μM的溶液（ 亚硝酸钠）。相同的溶液可用于亚硝酸盐和硝酸盐测定。
- 不使用分析仪
注意：目前有两种市售是用于生物研究的目的不够敏感NO分析仪-西弗斯NOA和Ecophysics CLD 88Y。他们都同样的原则进行操作;的主要区别在于，CLD 88Y使用氧气从室内空气，使臭氧（O 3），而NOA要求用于此目的的外部氧气罐。下面的过程说明了设立西弗斯NOA。- 仪器设置
- 根据制造商的建议进行NO分析仪的初始设置如看到的图1。
- 打开O 2罐连接到仪器。选择“分析”，并从面板上的主菜单中的“输入”。在下一屏幕上选择“开始”，然后按“Enter”键。 （含有1 M氢氧化钠）酸阱连接到仪器， 如图1中所见。
- 等到光电倍增冷却至温度低于-12℃，将反应室抽真空至6乇。大约需要30分钟才能达到稳定平稳的基线。基线需要1内稳定 - 2毫伏，其标称值比其稳定性不太重要。
注意：如果硝酸盐测量，打开冷却水浴（设定为4℃，作为冷阱为酸和水蒸汽）和加热水浴（主反应室中，95℃）。的硝酸盐还原成否的VCl 3溶液的速率是温度相关的，并且它在室温坦佩非常缓慢叉涂抹，需要温度，所以大幅度提高，观察反应。 - 打开他坦克和玻璃反应室连接到酸陷阱在图1中所看到。填充适当还原溶液的反应室，减少鼓泡到最小和反应室连接到酸陷阱。采用试错，调整他冒泡率匹配仪器吸率（对西瑞尔的NOA通常〜200毫升/分钟）。
- 打开电脑控制仪器并启动基于LabVIEW的Liquid软件。要打开仪器和采集软件，按之间的通信“进入”中的“数据菜单”，直到屏幕上显示“输出使能”的时候，然后按“清除”要返回数据的屏幕。
- 等待屏幕上的一个稳定的基线跟踪并开始注入样本和亚硝酸盐标准纳入通过隔膜还原溶液。总是等到达到稳定的基线船尾呃高峰。这最多需要2分钟。液体的软件有一个选项为“标记”时代注入和注释注入，它将这些意见导出到一个单独的文件（filename.info）作为一个有益的补充数据文件（filename.data）。
- 一旦样品和标准衡量，选择“停止”在Liquid软件菜单选项 - 这会从临时文件中的数据写入到被称为“filename.data”永久的文件。按“退出”选项，将终止测量没有获得的数据写入到一个永久文件。
- 终止实验，通过在反应容器的顶部关闭旋塞从反应容器断开机器并断开酸阱和反应容器之间的管（ 见图1）。现在停止NOA分析 - 按“清除”，进入“分析”，把机器上的“待机”和“确认”待命。如果经常，使用的仪器可在待机模式下放置数周。关闭氧气供应。然后冲洗从反应室，断开的还原性溶液，并关闭从玻璃反应容器中，他罐和完成清洁反应容器中。
- 标准和样品进样
- 注入50微升的1μM的亚硝酸盐溶液成使用公洗涤Hamilton注射器反应混合物。等待至少1 - 注射之间2分钟达到高峰的良好分离。 50微升重复注射以获得复制到每个数据点。每次注射后要用去离子水的注射器。
- 为了获得全套的标准曲线数据，继续与100，150微升重复注射1微米的亚硝酸盐溶液（如果预期的高浓度的亚硝酸盐或硝酸盐可能需要额外的200微升）。在每种情况下，照顾等到信号回落至基线，然后获得1 - 2英里基准的n个达到峰值的良好分离。
注意：亚硝酸盐的标准可在实验过程中的任何时间进行测量。然而，优选的是采集数据测量前的标准曲线，因为它也可作为仪器的功能的独立的检查。
当收集数据时，样品的注入量应导致良好明显的峰值。然而，应当记住的是，所述光电倍增管是线性的仅达〜800毫伏，所以没有峰应比〜700毫伏以上。这可以通过注入量样品的降低或用去离子水稀释的样品来实现任一。每个点应该至少一式两份进行测定。
- 仪器设置
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Representative Results
图2示出了从标准和五种不同样品收集代表性结果。如该图所示，光电倍增电压增加溶液（标准或样品）含亚硝酸注入还原溶液后立即返回到基线值的所有出现在注射一次亚硝酸盐（注射时间由曲线下方红色箭头表示）溶液降低。它也是从该图准确体积的测量是必要的，以获得高重现性的数据清楚。我们建议采用精密汉密尔顿注射器来衡量的注射量。减少I 3（或抗坏血酸或的VCl 3）溶液的能力的丧失是错误的另一种常见的来源。作为一般规则，当峰的基线宽度开始大大加宽，从而减少在反应室溶液必须被改变。峰的宽度取决于气体流入NO反应室（标记为RC的图1），并且它略微从一个实验装置到另一个而变化。我们考虑正常宽度成为亚硝酸盐的测量和最多2分钟为硝酸盐测量约1分钟。
以涉及从与检测到的NO的量的光电倍增管的信号，一个标准曲线构造为区域的峰下的曲线和亚硝酸盐的量（以pmol）注入所见图3A上。为了测量峰下的面积的任何合适的软件可以使用，如起源，Excel或喜欢。该曲线K（以红色标示在图3B）的斜率给出的光电倍增管（PM）信号的1毫伏否导致增加皮摩尔的量。使用下峰的曲线的斜率，而不是面积的优点，即是与否的固定量，增加精度。标准曲线是由至少3种不同的构造点，其中每一个在一式两份被测量并且如果存在一些残留的亚硝酸盐或硝酸盐用于制备标准溶液的水，用k消除更正此残余量的必要性。此外，按照我们的NOA仪初步测试其PM线性度，我们确定线性响应时可达700 - 800毫伏。因此，我们的标准曲线的有效期为从样品到这点范围内的所有信号。线性范围取决于PM和可能随时间变化。它需要首先使用和每几年PM年龄测试仪器前确定。
从样品中收集的数据以类似的方式处理所收集的标准曲线数据：首先，将峰下的面积被确定。然后这个区域是由标准曲线，它给出来自注入样品的量没有的皮摩尔数的斜率K份分割。
如图3B中的结果通常表示为亚硝酸盐或硝酸盐浓度（1nM或μM）对生物体液（血液，尿），或作为在固体样品的情况下皮摩尔/组织的克。数据随后类似地绘制于图3B中的例子。在图3B中给出的例子中，我们绘制从在面板A中显示5个独立样品的结果在这里，我们从2次注射绘制平均值和得到的SD显示单独点测量的再现性。
对于在图3的样品中，S1，S2和S4是大鼠血液和S3和S5大鼠肝。 图3C显示了最终的结果与SD一起绘制和nM表示（血液中，n = 3）或下午醇/ mg组织（肝脏中，n = 2）。
图1： 西弗斯NOA化学发光仪的安装。反应容器充满我3（抗坏血酸/乙酸或的VCl 3）溶液用He载气轻轻鼓泡通过。样品是使用Hamilton注射器通过隔膜进入我3解决方案，其中无相关的组件被还原成NO气体和携带成NO分析器注入。冷阱，氢氧化钠充满陷阱，和过滤器保护分析仪不受潮湿和酸性气体。在反应室（RC）NO气体与氧气罐氧气O 3（以O 3发生器产生）相结合。从的 NO 2 *的化学发光信号由光电倍增管（PMT）来检测，并进一步放大和处理。数据采集和分析都在PC上进行。真空泵创建低压反应室（RC）和通过炭过滤器（CF）的化学发光测定后抽空有毒的 NO 2气体。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：CL不会产生峰的代表性曲线。该曲线示出了光电倍增管（PMT）的信号作为时间的函数。从山峰不同量的1微米的亚硝酸盐溶液（标准）和100微升样品的注射导致（S1 - S5）一式两份，并注射一式三份（50微升的亚硝酸盐标准溶液）。曲线下红色箭头指示注射次数。 请点击此处查看拉rger版本这个数字。
图3： 标准曲线（A）和大鼠血液和肝脏（B）代表性的成果，最终结果图（C）。通过注入1μM的亚硝酸盐溶液50中，100和150微升水，下峰测量的区域获得的标准曲线（ 图A）。斜率，K（红色数字）给出了在光电倍增管电压1mV的增加不需要的纳摩尔。用于标准曲线原始峰是在图2和被标记为50，100和150微升。 图2还示出了用于我们的样品原注射- S1，S2和S4（深灰色）从大鼠血液，S3和S5从大鼠肝组织，所有注入一式两份。这些峰下面积进行测定，并后如在部分3.2.1中描述作出对稀释所有校正。，水库在对个体样本面板B中所示ULTS计算为以pmol / g的肝脏或以nM为血液亚硝酸盐的量。欣赏化学发光法的再现性，我们绘制为每个单独的样本的平均值和标准偏差。 面板C显示了最终产品亚硝酸盐和硝酸盐在大鼠血液和肝脏一起绘制成平均血液和二三个别样品的肝与标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
该议定书中的关键步骤
用于制备，稀释或以其他方式处理原始样品的所有解决方案（包括水）的等分试样必须保存并检查可能的亚硝酸盐或（更通常）硝酸盐的污染。我们发现大多数污染来自水和用于治疗样品（铁氰化物，特别）许多化学物质也包含在一些地段，与内源性的硝酸盐判定干扰硝酸盐污染的显著量。因此，我们检查所有化学品我们对亚硝酸盐和硝酸盐污染之前，我们经常在实验中使用它们。
因为样品可能在治疗遭受大量稀释几倍，所有样品的操作需要记录为最终浓度的计算。大多数的错误是在协议的这部分进行。
在处理样品亚硝酸盐测量，快速转入亚硝酸盐保存液是至关重要的，特别是当含血红素的蛋白质，如血红蛋白，即用亚反应，并将其氧化成硝酸盐，都存在。一旦稳定下来，样品可以冷冻试验之前长时间存放。
生物样品（特别是RX-NO）的几个NO代谢物的量是非常低的，有时产生NO的水平是在NOA分析仪的背景噪声电平。它始终是优选尽可能少稀释尽可能制备样品，如果这样的化合物进行测量。
该技术的局限性
通过仔细的样品制备和注射，灵敏度下限为接近20纳米不存在加合物的充分准备样本。亚硝酸盐和硝酸盐的常用生物浓度肯定要超过这些浓度，然而，R-（X）-NO金额可能落在接近这个范围内。
CL高森敏度要求认真样品制备和精确的体积测量。
就以NO代谢物测量的替代方法CL意义
化学发光（CL）是检测NO，亚硝酸盐，硝酸盐和RX-NO一个非常敏感的方法。目前，CL被认为是决定NO及其代谢物的金标准。
其他常见的替代，以确定亚硝酸盐的格里斯反应（GR）。 GR是基于彼得·格里斯硝酸盐的1879年分析描述重氮化反应的方便和廉价比色法需要事先化学或酶法硝酸盐还原成亚硝酸盐。目前最好的市售试剂盒对亚硝酸盐100nm左右的灵敏度，最让包来确定硝酸盐和硝酸盐的敏感性低μM范围。当使用GR，以确定亚硝酸盐和硝酸盐在样品中，需要两个步骤;首先，确定亚硝酸盐上午'mount样品的第一等分，然后用第二份减少到硝酸盐和亚硝酸盐测定总亚硝酸盐和硝酸盐（有时也被称为NOx）的样品含量。真硝酸盐值是两次测量的差异。这两个步骤协议更好的选择是用色谱法硝酸盐和亚硝酸盐的预先分离。但是，这种显着降低的敏感性和增加了分析时间。
未来应用
随着对生物系统NO通路的重要性越来越多的证据，我们预计的更频繁地使用亚硝酸盐或硝酸盐或其他代谢产物NO作为心血管健康的生物标志物。增加的证据也表明，这些分子可以在运动医学重要和它们的水平可能在人与糖尿病，肥胖症和代谢综合征被改变。
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Disclosures
艾伦·谢克特博士被列为在发给美国国立卫生研究院的使用亚硝酸盐对心血管疾病的治疗几项专利的共同发明人。他接收基于这些专利用于临床开发，但没有其他补偿NIH许可费。
Acknowledgments
作者要感谢在制定血液中的亚硝酸盐测量使用亚硝酸盐保存液A. Dejam博士和MM佩尔蒂埃的重要贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| sulfanilamide; AS | Sigma | S9251 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| acetic acid, glacial | Sigma | A9967 | |
| ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| potassium iodide; KI | Sigma | 60399 | |
| iodine; I2 | Sigma | 207772 | light sensitive, toxic |
| sodium nitrite; NaNO2 | Sigma | 563218 | |
| vanadium(III) chloride; VCl3 | Sigma | 208272 | ligt sensitive, toxic |
| GentleMac | Miltenyi | ||
| Sievers NOA 280i | GE | ||
| CLD 88Y | Ecophysics |
References
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