Summary

全血からのヒト単球由来樹状細胞の生成

Published: December 24, 2016
doi:

Summary

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Abstract

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.

The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Introduction

樹状細胞(DC)は、我々の免疫系の最も重要な特殊な抗原提示細胞です。未成熟DC(iDCを)は、皮膚または粘膜組織に存在し、侵入する病原体と対話するための最初の免疫細胞の間で、したがってあります。彼らは病原体検出、次のTおよびB細胞応答を活性化することができますので、DCは、先天性および適応免疫系1との間のブリッジを表します。さらに、それらは、IL-1β、IL-6、およびIL-12などのためのサイトカインの多量の分泌の前炎症性免疫応答に寄与する。 DCはまた、NK細胞を活性化および走化性によって感染部位に他の免疫細胞を引き付けます。

DCは、未成熟樹状細胞(iDCを)とその形態および機能に基づいて、成熟樹状細胞(mDCの)2に分けることができます。多くのパターン認識受容体( 例えば、Toll様受容体、C型の1による外来抗原の認識後レクチン、または豊富に細胞表面に発現)受容体を補完する、iDCをは大きな変化を受け、成熟し始めます。この成熟過程の間に、抗原捕獲のための受容体はダウンレギュレートされ、抗原提示に必須の分子がアップレギュレートされている一方、3。成熟DCアップレギュレート主要組織適合遺伝子複合体の抗原提示およびTリンパ球の活性化に必須であるCD80およびCD86のようなIおよびII(MHC I及びII)、共刺激分子、。さらに、細胞表面上のケモカイン受容体CCR7の発現は、リンパ節への末梢組織からのDCの移動を可能にする、誘導されます。移行は、リンパ節4-6のケモカインリガンド19(CCL19 / MIP-3B)およびケモカインリガンド21(CCL21 / SLC)の勾配に沿ってDCの「ローリング」によって促進されます。

移行後、mDCのは、このように、INI、CD4 +およびCD8 + T細胞をナイーブために処理抗原を提示します侵入病原体7に対する適応免疫応答をtiating。リンパ節におけるT細胞とのこの相互作用は、ウイルス8の広がりに関連しています。他のインビトロの研究では、DCが効率的に捕捉し、活発な感染9-12にこの送信結果T細胞へとすることをHIVを移すことを明らかにしました。これらの実験は、リンパ節への周囲からのシャトルバスとしてそのin vivoでの HIVの悪用のDCを強調表示します。抗原提示の間、DCは、エフェクターTヘルパー細胞の分化を形成し、したがって、微生物に対する全免疫応答の結果は、この非常に相互作用で決定されたキーのインターロイキンを分泌します。別にタイプ1(のTh1)および2型(Th2の)エフェクターT細胞、CD4 + Tヘルパー細胞の他のサブセット( 例えば、タイプ17(Th17細胞)およびタイプ22(TH22)T細胞)が記載されており、それらの誘導から、および機能は徹底的に研究されてきました。 DCはさらに、に関与しています制御性T細胞(Treg)13,14の世代。これらの細胞は免疫抑制性であり、停止または誘導またはエフェクターT細胞の増殖をダウンレギュレートし、従って免疫寛容を開発するために重要であることができます。

人間従来のDC(のCDC)は、骨髄起源( すなわち、ランゲルハンス細胞(LCS)と皮膚との間質のDC)またはリンパ系起源( すなわち、形質のDC(pDCに))を用いた細胞のいくつかのサブセットを含みます。 インビトロ実験またはDCワクチン接種戦略は、単球由来のDCは、日常的に、皮膚のDCのモデルとして使用されています。これらの細胞は、従来の骨髄樹状細胞への生理、形態学、および機能の類似性を示します。これらは、健康なドナー12,15-18から単離された単球のインターロイキン4(IL-4)および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を添加することによって生成されます。樹状細胞は、直接、皮膚または粘膜生検から単離することができる、またはできても、Beは子宮外を得た臍帯血サンプルから単離したCD34 +造血前駆細胞から開発します。ここでは、単球を単離し、密度勾配遠心分離により末梢血単核細胞(PBMC)、濃縮した後、抗凝固処理ヒト血液から刺激される方法を示しています。 5日間インキュベートした後、特定の条件下でヒト単球は、iDCをに分化され、非臨床設定において実験手順の準備ができています。

Protocol

倫理の声明:書面によるインフォームドコンセントは、輸血&免疫学専攻、インスブルック、オーストリア中央研究所によってすべての参加血液ドナーから得ました。科学的な目的のために匿名残りの標本の使用はインスブルック医科大学の倫理委員会によって承認されました。 末梢血単核細胞(PBMC)の1濃縮 遠心分離によるPBMCの濃度。 受け取った血液の量?…

Representative Results

スクロースクッションを用いて抗凝固処理血液の遠心分離後、末梢血単核細胞(PBMC)は、密度勾配媒体( 図1)の上に中間相が富化されています。 PBMCを引き出された後、FACS分析は、(Bリンパ球のために、例えば、Tリンパ球のためのCD3、単球のためのCD14、およびCD19)系列マーカーを用いたPBMC内の異なる細胞集団を特徴付けるために行われます。…

Discussion

このプロトコルは、磁性ナノ粒子ベースのアッセイを用いて抗凝固血液からヒト単球の単離を通して単球由来樹状細胞(MDDCs)の生成を説明しています。このプロトコルでは、遠心分離工程は、PBMC画分の濃縮につながる細胞単離手順、上流で行われます。細胞を遠心分離中に失われているが、密度勾配媒体200〜300ミリリットル必要とする密度勾配媒体の全血パックの内容をオーバーレイし、?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank our technician Karolin Thurnes, Divison of Hygiene and Medical Microbiology, and Dr. Annelies Mühlbacher and Dr. Paul Hörtnagl, Central Institute for Blood Transfusion and Immunological Department, for their valuable help and support regarding this manuscript. We thank the Austrian Science Fund for supporting this work (P24598 to DW, P25389 to WP).

Materials

APC Mouse Anti-Human CD19  Clone  HIB19 BD Biosciences 555415
APC Mouse Anti-Human CD83  Clone  HB15e BD Biosciences 551073
BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles  BD Biosciences 557769
BD Imagnet BD Biosciences 552311
BSA (Albumin Fraction V) Carl Roth EG-Nr 2923225
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Costar 3506
Density gradient media: Ficoll-Paque Premium GE Healthcare Bio-Sciences 17-5442-03
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) Sigma-Aldrich D8537
Falcon 10mL Serological Pipet Corning 357551
Falcon 25mL Serological Pipet Corning 357525
Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube Corning 352070
Falcon Round-Bottom Tubes Corning 352054
FITC Mouse Anti-Human CD3  Clone  HIT3a BD Biosciences 555339
Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) Tonbo biosciences 13-0870
GM-CSF MACS Miltenyi Biotec 130-093-862
Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) Gibco 10500-064
Hettich Rotanta 460R Hettich
IL-4 CC PromoKine C-61401
Isolation buffer: BD IMag Buffer (10X)  BD Biosciences 552362
L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513
Microcentrifuge tubes, 1,5 ml, SuperSpin VWR 211-0015
PE Mouse Anti-Human CD14  Clone  M5E2 BD Biosciences 555398
PE Mouse Anti-Human CD209  Clone  DCN46 BD Biosciences 551265
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R0883
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020

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Cite This Article
Posch, W., Lass-Flörl, C., Wilflingseder, D. Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood. J. Vis. Exp. (118), e54968, doi:10.3791/54968 (2016).

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