Summary

Поколение человеческих моноцитов дендритных клеток из цельной крови

Published: December 24, 2016
doi:

Summary

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Abstract

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.

The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Introduction

Дендритные клетки (ДК) являются наиболее важными специализированными антиген-представляющих клеток нашей иммунной системы. Незрелые РС (IDCS) находятся в коже или в тканях слизистой оболочки и поэтому среди первых иммунных клеток, чтобы взаимодействовать с вторгающихся патогенов. Контроллеры домена представляют собой мост между врожденной и адаптивной иммунной системы 1, так как они могут активировать Т- и В-клеточные реакции после обнаружения патогенных микроорганизмов. Кроме того, они способствуют провоспалительных иммунных реакций, из-за выделения больших количеств цитокинов, таких как IL-1, IL-6 и IL-12. Контроллеры домена также активирует клетки NK и привлечь другие иммунные клетки к месту инфекции хемотаксиса.

Контроллеры домена могут быть разделены на незрелые дендритные клетки (МССД) и зрелых дендритных клеток (MDCs) 2 на основе их морфологии и функции. После распознавания чужеродных антигенов одним из множества распознающих рецепторов (например, Toll-подобные рецепторы, С-типалектины, или дополнять рецепторы) в большом количестве экспрессируется на поверхности клетки, IDCS претерпит серьезные изменения и начинают созревать. Во время этого процесса созревания, рецепторы для захвата антигена вниз регулируется, в то время как молекулы , необходимые для презентации антигена являются повышающей регуляции 3. Зрелые контроллеры домена до регулировать основных комплексов гистосовместимости I и II (MHC I и II), Co-стимулирующего молекулы, такие как CD80 и CD86, которые имеют важное значение для презентации антигена и активации Т-лимфоцитов. Кроме того, экспрессия рецептора хемокина CCR7 на поверхности клеток индуцируется, что позволяет миграцию контроллеров домена из периферических тканей к лимфатическим узлам. Миграция способствует "прокатки" ДК вдоль хемокинным лиганда 19 (CCL19 / MIP-3b) и хемокина лиганд 21 (CCL21 / SLC) градиента к лимфатическим узлам 4-6.

После миграции, MDCs представить обработанный антиген наивных CD4 + и CD8 + Т – клеток, таким образом , иниtiating адаптивный иммунный ответ против вторгшегося возбудителя 7. Это взаимодействие с Т – клетками в лимфатических узлах , также связано с распространением вируса 8. Другие исследования в пробирке показали , что контроллеры домена эффективно захвата и передачи ВИЧ Т – клеток и что это результаты передачи в энергичном инфекции 9-12. Эти эксперименты подчеркивают , что в естественных условиях РС ВИЧ подвиги , как челноки от периферии к лимфатическим узлам. Во время презентации антигена, контроллеры домена выделяют ключевые интерлейкины, которые формируют дифференциацию эффекторных Т-клеток-хелперов, и, следовательно, исход всего иммунного ответа против микроба определяется при этом самого взаимодействия. Помимо типа 1 (Th1) и типа 2 (Th2) эффекторные Т – клетки, другие подмножества клеток – хелперов CD4 + Т (например, тип 17 (Th17) и тип 22 (Th22) Т – клетки) были описаны, и их индукция и функции были тщательно исследованы. ДК, кроме того, участвует вгенерация регуляторных Т – клеток (Tregs) 13,14. Эти клетки являются иммунодепрессивное и могут остановить или понижающей регуляции индукции или пролиферации эффекторных Т-клеток и, таким образом, решающее значение для развития иммунитета и толерантности.

Человеческие обычные контроллеры домена (CDCs) содержат несколько подмножеств клеток с миелоидного происхождения (т.е. клеток Лангерганса (LCS) и кожная и интерстициальные РСУ) или лимфоидной происхождения (т.е. плазмоцитов контроллеры домена (PDCs)). Для экспериментов в пробирке или стратегии вакцинации DC, моноцитов контроллеры домена , которые обычно используются в качестве модели для кожными контроллеров домена. Эти клетки демонстрируют сходство в физиологии, морфологии и функции с обычными миелоидные дендритные клетки. Они генерируются путем добавления интерлейкина 4 (IL-4) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) , моноцитов , выделенных из здоровых доноров 12,15-18. Дендритные клетки также могут быть непосредственно выделены из дермальных или слизистыми биопсий, или может даже бе развился из CD34 + гемопоэтических клеток – предшественников , выделенных из образцов пуповинной крови , полученных ех внутриутробного развития. Здесь показано, как моноциты изолированы и стимулировали от анти-свернувшегося крови человека после того, как мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) обогащения центрифугированием в градиенте плотности. После инкубации в течение 5 дней, моноциты человека при определенных условиях дифференцированы в IDCS и готовы к экспериментальным процедурам в доклинических условиях.

Protocol

Этика заявление: письменное информированное согласие было получено от всех участвующих доноров крови Центрального института переливания крови и отдела иммунологические, Инсбрук, Австрия. Использование обезличенных образцов оставшимися в научных целях было одобрено Комитетом по этике Медицин?…

Representative Results

После центрифугирования анти-свернувшейся крови , используя подушку сахарозы, одноядерные клетки периферической крови (РВМС) обогащены в интерфазе на верхней части градиента плотности среды (рисунок 1). После того , как МНПК отсасывают, анализ FACS выполняется ?…

Discussion

Этот протокол описывает генерацию моноцитов дендритные клетки (MDDCs) через изоляцию человеческих моноцитов из анти-свернувшейся крови с использованием магнитной наночастицы на основе анализа. В этом протоколе, этапы центрифугирования выполняют перед процедурой выделения клеток, что ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank our technician Karolin Thurnes, Divison of Hygiene and Medical Microbiology, and Dr. Annelies Mühlbacher and Dr. Paul Hörtnagl, Central Institute for Blood Transfusion and Immunological Department, for their valuable help and support regarding this manuscript. We thank the Austrian Science Fund for supporting this work (P24598 to DW, P25389 to WP).

Materials

APC Mouse Anti-Human CD19  Clone  HIB19 BD Biosciences 555415
APC Mouse Anti-Human CD83  Clone  HB15e BD Biosciences 551073
BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles  BD Biosciences 557769
BD Imagnet BD Biosciences 552311
BSA (Albumin Fraction V) Carl Roth EG-Nr 2923225
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Costar 3506
Density gradient media: Ficoll-Paque Premium GE Healthcare Bio-Sciences 17-5442-03
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) Sigma-Aldrich D8537
Falcon 10mL Serological Pipet Corning 357551
Falcon 25mL Serological Pipet Corning 357525
Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube Corning 352070
Falcon Round-Bottom Tubes Corning 352054
FITC Mouse Anti-Human CD3  Clone  HIT3a BD Biosciences 555339
Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) Tonbo biosciences 13-0870
GM-CSF MACS Miltenyi Biotec 130-093-862
Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) Gibco 10500-064
Hettich Rotanta 460R Hettich
IL-4 CC PromoKine C-61401
Isolation buffer: BD IMag Buffer (10X)  BD Biosciences 552362
L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513
Microcentrifuge tubes, 1,5 ml, SuperSpin VWR 211-0015
PE Mouse Anti-Human CD14  Clone  M5E2 BD Biosciences 555398
PE Mouse Anti-Human CD209  Clone  DCN46 BD Biosciences 551265
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R0883
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020

References

  1. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  2. Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
  3. Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies. Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).
  4. Schwarz, J., Sixt, M. Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis. Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).
  5. Weber, M., Sixt, M. Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations. Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).
  6. Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).
  7. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
  8. Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV. Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).
  9. Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells. J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).
  10. McDonald, D., et al. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
  11. Pruenster, M., et al. C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells. Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).
  12. Wilflingseder, D., et al. IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells. J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).
  13. Kapsenberg, M. L. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).
  14. Mills, K. H. TLR-dependent T cell activation in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).
  15. Banki, Z., et al. Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs. PLoS Pathog. 6, e1000891 (2010).
  16. Posch, W., et al. Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 130, 1368-1374 (2012).
  17. Posch, W., et al. Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11, e1005005 (2015).
  18. Wilflingseder, D., et al. Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells. J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).
  19. Grassi, F., et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules. J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).

Play Video

Cite This Article
Posch, W., Lass-Flörl, C., Wilflingseder, D. Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood. J. Vis. Exp. (118), e54968, doi:10.3791/54968 (2016).

View Video