Intuizioni le interazioni di aminoacidi e peptidi con materiali inorganici Uso singola molecola Forza Spettroscopia
Summary
Qui vi presentiamo un protocollo per misurare la forza di interazione fra una superficie inorganica ben definita e sia peptidi o aminoacidi mediante spettroscopia forza singola molecola utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM). Le informazioni ottenute dalla misurazione è importante per capire meglio la interfase materiale peptide-inorganico.
Abstract
Le interazioni tra proteine o peptidi e materiali inorganici portano a diversi processi interessanti. Per esempio, combinando proteine con minerali porta alla formazione di materiali compositi con proprietà uniche. Inoltre, il processo indesiderabile di biofouling è iniziata dal adsorbimento di biomolecole, principalmente proteine su superfici. Questo strato organico è uno strato di adesione per i batteri e permette loro di interagire con la superficie. La comprensione delle forze fondamentali che governano le interazioni all'interfaccia organico-inorganico è quindi importante per molti settori della ricerca e potrebbe portare alla progettazione di nuovi materiali per applicazioni ottiche, meccaniche e biomediche. Questo documento illustra una tecnica di spettroscopia di forza singola molecola che utilizza un AFM per misurare la forza di adesione tra entrambi peptidi o amminoacidi e superfici inorganiche ben definiti. Questa tecnica comporta un protocollo per fissare la biomolecola alla AFMpunta attraverso un covalente linker flessibile e misure di spettroscopia di forza singola molecola al microscopio a forza atomica. Inoltre, l'analisi di queste misure è incluso.
Introduction
L'interazione tra proteine e minerali inorganici porta alla costruzione di materiali compositi con caratteristiche distintive. Questo comprende materiali ad elevata resistenza meccanica e proprietà ottiche uniche. 1, 2, ad esempio, la combinazione del collagene proteina con l'idrossiapatite minerale genera sia ossa molli o duri per diverse funzionalità. 3 peptidi brevi possono anche legare materiali inorganici con elevata specificità. 4, 5, 6 La specificità di questi peptidi sono stati utilizzati per la progettazione di nuovi materiali magnetici ed elettronici, 7, 8, 9 fabbricare materiali nanostrutturati, crescita di cristalli, 10 e sintetizzare le nanoparticelle. 11 Comprendere il meccanismo alla base delle interazioni tra i peptidi o proteine e materiali inorganici sarà quindi permetterà di progettare nuovi materiali compositi con migliorate proprietà di adsorbimento. Inoltre, poiché l'interfase di impianti con una risposta immunitaria è mediata da proteine, una migliore comprensione delle interazioni di proteine con materiali inorganici migliorerà la nostra capacità di progettare impianti. Un'altra area importante che coinvolge le proteine interagenti con superfici inorganiche è la fabbricazione di materiali antivegetative. 12, 13, 14, 15 Biofouling è un processo indesiderabile in cui gli organismi attribuiscono ad una superficie. Esso ha molte implicazioni negative sulle nostre vite. Ad esempio, biofouling di batteri sui dispositivi medici porta a infezioni nosocomiali. Biofouling di organismi marini su barche e grandi navi aumenta la consumo di carburante. 12, 16, 17, 18
Singola molecola di forza spettroscopia (SMFS), utilizzando un AFM, può misurare direttamente le interazioni tra un amminoacido o peptide con un substrato. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 Altri metodi come phage display, 27, 28 quarzo microbilancia cristallo (QCM) 29 o risonanza plasmonica di superficie (SPR) 29, 30, 31, 32,ref "> 33 misura le interazioni di peptidi e proteine su superfici inorganiche alla rinfusa. 34, 35, 36 Ciò significa che i risultati ottenuti con questi metodi si riferiscono a gruppi di molecole o aggregati. In SMFS, una o poche molecole sono fissati alla punta AFM e le loro interazioni con il substrato desiderato viene misurata. Questo approccio può essere esteso per studiare ripiegamento proteico tirando la proteina dalla superficie. Inoltre, può essere utilizzato per misurare le interazioni tra le cellule e proteine e il legame di anticorpi ai loro ligandi. 37, 38, 39, 40 Questo documento descrive in dettaglio come collegare sia peptidi o amminoacidi fino alla punta AFM con silanolo chimica. Inoltre, il documento spiega come eseguire misurazioni di forza e come analizzare larisultati.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passi 1.3, 1.4 e 1.7 nel protocollo devono essere effettuate con una vasta cura e in modo molto delicato. Nel passo 1.3, la punta non deve essere in contatto con la miscela silano e il processo di silanizzazione deve essere effettuata in atmosfera inerte (umidità libera). 45 Questo viene fatto al fine di prevenire la formazione di strati e perché le molecole di silano facilmente subiscono idrolisi in presenza di umidità. 45
Nel passo 1.4, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Marie Curie International Reintegration Grant (EP7). P. D. acknowledges the support of the Israel Council for Higher Education.
Materials
| Silicon nitride (Si3N4) AFM cantilevers with silicon tips | Bruker (Camarilo, CA, USA) | MSNL10, nominal cantilevers radius ~2 nm | |
| Methyltriethoxysilane | Acros Organics (New Jersey, USA) | For Silaylation of the AFM tip | |
| 3-(Aminopropyl) triethoxysilane | Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) | Used for tip modification | |
| Triisopropylsilane | Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) | Used for tip modification | |
| N-Ethyldiisopropylamine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip modification | |
| Triethylamine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip modification | |
| Piperidine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip modification | |
| Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide (Fmoc-PEG-NHS) | Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany) | Used as the covalent flexible linker (MW = 5000 Da) | |
| 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) | Alfa Aser (Heysham, England) | Used as a coupling reagent. | |
| N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) | Acros Organics (New Jersey, USA) | Used as Solvent in Tip modification procedure | |
| DMF (dimethylformamide) | Merck (Darmstadt, Germany) | Used as Solvent in Tip modification procedure | |
| Trifluoro acetic acid (TFA) | Merck (Darmstadt, Germany) | ||
| Acetic anhydride | Merck (Darmstadt, Germany) | ||
| Peptides | GL Biochem (Shanghai, China). | ||
| Phenylalanine and Tyrosine | Biochem (Darmstadt, Germany) | ||
| 30% TiO2 dispersion in the mixture of solvent 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP) | Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel) | (30%) in the mixture of solvent 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP) | |
| Mica substrates | TED PELLA, INC. (Redding, California, USA) | 9.9 mm diameter |
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