Grootschalige Reconstructies en Onafhankelijk, Unbiased Clustering Gebaseerd op morfologische Metrics om neuronen te classificeren in Selective Populaties
Summary
Dit protocol beschrijft grootschalige reconstructies van selectieve neuronale populaties, het label na retrograde infectie met een gemodificeerde rabiësvirus uiten van fluorescerende markers, en onafhankelijke, onpartijdige cluster analyses waarmee uitgebreide karakterisering van morfologische metrics onder verschillende neuronale subklassen.
Abstract
Dit protocol beschrijft grootschalige reconstructies van neuronen in combinatie met het gebruik van onafhankelijke en onpartijdige clustering analyses om een uitgebreid onderzoek van de morfologische kenmerken waargenomen bij een selectieve neuronale populatie te creëren. Combinatie van deze technieken is een nieuwe benadering voor het verzamelen en analyseren van neuroanatomische data. Samen vormen deze technieken in grootschalige en dus uitgebreidere steekproef van selectieve neuronale populaties en vastgesteld onpartijdige kwantitatieve methoden ter indeling morfologisch unieke neuronale klassen binnen een populatie.
Het protocol beschrijft het gebruik van gemodificeerde rabiësvirus selectief labelen neuronen. G-verwijderde rabies virus gedraagt zich als een retrograde tracer na stereotaxische injectie in een doel hersenstructuur van belang en dient als een voertuig voor de levering en expressie van EGFP in neuronen. Grote aantallen neuronen geïnfecteerd met dezetechniek en express GFP gedurende hun dendrieten, het produceren van "Golgi-achtige" compleet fills van individuele neuronen. Dienovereenkomstig, de virus-gemedieerde retrograde tracing methode verbetert traditionele dye-basis retrograde tracing technieken door het produceren van volledige intracellulaire fills.
Individuele goed geïsoleerde neuronen verspreid over alle regio's van de hersenen gebied onder onderzoek zijn geselecteerd voor de wederopbouw met het oog op een representatieve steekproef van neuronen te verkrijgen. Het protocol beschrijft procedures om cellichamen te reconstrueren en te voltooien dendritische arborization patronen van gelabelde neuronen verspreid over meerdere weefselcoupes. Morfologische gegevens, inclusief posities van elk neuron in de hersenen structuur, worden verwijderd voor verdere analyse. Standaard programmering functies werden gebruikt om onafhankelijke cluster analyses en evaluaties cluster op basis van morfologische metrics te voeren. Het nut van deze analyses, statistische beoordeling van clusteranalyse perfo verifiërenrmed op 160 neuronen gereconstrueerd in de thalamische reticulaire nucleus van de thalamus (TRN) van de makaak werd gemaakt. Zowel de originele clusteranalyse en statistische evaluaties uitgevoerd hier aan dat TRN neuronen in drie subpopulaties, elk met unieke morfologische kenmerken.
Introduction
Neuroanatomie is een van de fundamenten van de neurowetenschappen 1 en recente interesse in "connectomics" heeft enthousiasme verlengd voor het begrijpen van de morfologische diversiteit van neuronale populaties en de verbindingen tussen specifieke neuronen 2. Methoden voor de etikettering en de reconstructie van neuronen zijn sterk verbeterd met recente innovaties, met inbegrip van genetische en virus-gemedieerde circuit tracing komt 3, 4, waardoor meer uitgebreide morfologische onderzoeken van neuronale populaties 5. Naast verbeteringen in de etikettering van individuele neuronen, hebben kwantitatieve data-analysetechnieken ook naar voren gekomen dat in staat stellen onafhankelijke en onpartijdige indeling van neuronen in afzonderlijke subpopulaties op basis van morfologische gegevens 5, 6. Deze onpartijdige technieken zijn een verbetering ten opzichte van meer traditional kwalitatieve indeling methoden die de standaard in het veld voor meer dan een eeuw zijn geweest. Het doel van deze studie is om te schetsen, stap-voor-stap, de combinatie van virus-gemedieerde etikettering van neuronen binnen een selectief bevolking, grootschalige reconstructies van een uitgebreide steekproef van deze neuronen, en kwantitatieve data-analyse op basis van onafhankelijke clustering met statistische evaluatie. Door het combineren van deze methoden, schetsen we een nieuwe aanpak in de richting van het verzamelen en analyseren van gegevens neuroanatomische uitgebreide bemonstering en onpartijdige classificatie van morfologisch unieke neuronale types binnen een selectieve neuronale bevolking te vergemakkelijken.
Als voorbeeld van deze werkwijzen beschrijven we onze analyse van een grote populatie van neuronen binnen één sector van de thalamische reticulaire nucleus (TRN) van de makaak. Deze gegevens zijn afkomstig uit een eerdere studie 7. Werkwijzen voor het selectief labelen TRN neuronen projecteren naar de dorsale lateral geniculate nucleus van de thalamus (dLGN) met behulp van chirurgische injectie van gemodificeerde rabiësvirus coderend EGFP 4, 8 (zie Tabel van specifieke materialen / apparatuur, rij 2) worden beschreven. Deze gemodificeerde rabies virus mist het gen dat codeert voor een essentieel manteleiwit, waardoor trans-synaptische beweging van het virus. Zodra het virus komt axon terminals op de injectieplaats, fungeert als een traditionele retrograde tracer met het belangrijkste voordeel van het rijden EGFP expressie gedurende de volledige dendritische arborization van geïnfecteerde neuronen 5, 9, 10. Bijgevolg kan deze-G verwijderd rabiësvirus worden gebruikt om selectief te infecteren en label elke neuronale bevolking na de injectie en retrograde transport.
Om een uitgebreide analyse van specifieke neuronale populatie te voeren, is het belangrijk om te proeven vaneen brede spreiding van neuronen in de bevolking. Omdat het virus-gemedieerde labeling techniek produceert volledig intracellulair, "Golgi-achtige" vullingen van vele neuronen met axonen op de injectieplaats virus, is het mogelijk om een zeer grote groep neuronen reconstrueren binnen de volledige omvang van een hersenstructuur. Bovendien, omdat de gemodificeerde rabiësvirus zo effectief bij infecteren en etikettering grote aantallen neuronen, is het mogelijk om honderden neuronen per dier te reconstrueren. Procedures voor het bemonsteren van 160 neuronen in de hele visuele sector van de TRN 11 met het oog op een uitgebreide steekproef van dLGN-projecteren TRN neuronen te genereren worden geschetst. Het proces van reconstructie van individuele neuronen met een neuron reconstructie omvattende een microscoop, camera en reconstructie software wordt beschreven. Eveneens beschreven worden werkwijzen posities van individuele neuronen in hersenen structuur (in dit geval binnen de TRN) bepalen en Virusinjectie sit verifiërene volume en locatie binnen een structuur (in dit geval binnen de dLGN) via volumemeting contour reconstructies. Stappen voor morfologische gegevens te exporteren en het uitvoeren van onafhankelijke cluster analyses op basis van morfologische metrieken gemeten voor elke neuron worden geschetst. Er zijn beperkingen aan clustering methoden en er zijn ook een verscheidenheid van verschillende clustering algoritmen beschikbaar. Dienovereenkomstig deze opties en de voordelen van enkele van de meest gebruikte algoritmen worden beschreven. Het cluster analyse geeft geen statistische controle van de uniciteit van clusters. Daarom zijn extra stappen optimale clustering en de relaties tussen morfologische data binnen en tussen clusters verifiëren. Statistische methoden voor het evalueren van clusters voor de TRN dataset om te bevestigen dat TRN neuronen zijn gegroepeerd in drie unieke clusters gebaseerd op 10 onafhankelijke morfologische metrics worden beschreven.
Door dus waarin stappen voor het selectief etiketteren, Reconstrueren en analyseren van morfologische gegevens van een specifieke neuronale populatie beschrijven we werkwijzen voor het kwantificeren morfologische verschillen tussen neuronen binnen een populatie. Voorafgaande bevindingen van verschillende neuronale types binnen de beeldende sector van de makaak TRN worden bevestigd met een aparte statistische evaluatiemethoden. Samen hopen we deze technieken zullen breed toepasbaar neuroanatomische datasets zijn en helpen bij het vaststellen kwantitatief onderzoek naar de diversiteit van de neuronale populaties door de hersenen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neuroanatomische studies zijn gebleven een van de pijlers van de neurowetenschappen en de recente interesse in connectomics en structuur-functie relaties heeft het enthousiasme verlengd voor gedetailleerde morfologische karakterisatie van selectieve neuronale populaties. Traditioneel zijn neuroanatomische studies vertrouwd op kwalitatieve indeling van neuronen in morfologisch verschillende klassen van neuronen die door deskundige neuroanatomists. Met de vooruitgang in de techniek voor het reconstrueren neuronen en extra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Drs. Ed Callaway en Marty Usrey voor het mogelijk maken om het weefsel bereid als een onderdeel van een eerdere studie en Libby Fairless en Shiyuan Liu voor hulp bij neuronale reconstructies gebruiken. Dit werk werd gefinancierd door de NIH (NEI: EY018683) en de Whitehall Foundation.
Materials
| SADΔG-EGFP | E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute | Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core | |
| Recording electrode: platinum/iridium or tungsten | FHC | UEPSGGSE1N2M | Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications |
| Nanoject II | Drummod Scientific | 3-000-204, 110V | Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe |
| Freezing microtome | Thermo Scientific | ||
| DAB | Sigma Aldrich | D5905-50TAB | 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen – must be bleached before discarding |
| Cytochrome C | Sigma Aldrich | C2037-100MG | |
| Catalase | Sigma-Aldich | C9322-5G | |
| Rabbit anti-GFP | Life Technologies/Thermo Fisher | #A-11122 | Primary antibody |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | #BA-1000 | Secondary antibody |
| Neurolucida System | MicroBrightField | Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida | |
| Neurolucida Explorer | MicroBrightField | Data export software | |
| Microfire Camera | Optronics | 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf | |
| Nikon E800 Microscope | Nikon Instruments Inc. | Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html | |
| Matlab | The MathWorks Inc. | Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Spreadsheet program |
References
- Cajal, S. R. y. . Histologie du systeme nerveaux de l’homme et des vertebres. , (1911).
- Seung, H. S. Toward functional connectomics. Nature. 471, 170-172 (2011).
- Callaway, E. M. Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses. Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).
- Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus. Nature Methods. 4, 47-49 (2007).
- Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey. Neuron. 90, 388-399 (2016).
- Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. PNAS. 97, 6144-6149 (2000).
- Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus. J. Comparative Neurology. 525 (5), 1273-1290 (2017).
- Osakada, F., et al. New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits. Neuron. 71, 617-631 (2011).
- Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses. Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).
- Nhan, H. L., Callaway, E. M. Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex. J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).
- Pinault, D. The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept. Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, e3564 (2012).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Research. 171, 11-28 (1979).
- Gerfen, C. R. Basic neuroanatomical methods. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1 (2003).
- Thorndike, R. L. Who belongs in the family?. Psychometrika. 18, 267-276 (1953).
- Talebi, V., Baker, C. I. Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex. Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).
