Großflächige Rekonstruktionen und Independent, Unvoreingenommene Clustering Basierend auf Morphologische Metriken Klassifizieren Neurons in Selective Populations
Summary
Dieses Protokoll beschreibt groß angelegte Rekonstruktion selektiver neuronaler Populationen, etikettiert folgende retrograden Infektion mit einem modifizierten Tollwutvirus Fluoreszenzmarker exprimieren, und unabhängig, unvoreingenommen Clusteranalysen, umfassende Charakterisierung der morphologischen Metriken unter verschiedene neuronale Subklassen ermöglichen.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt groß angelegte Rekonstruktion von Neuronen, die mit der Verwendung von unabhängigen und unvoreingenommenen Clustering kombiniert Analysen einen umfassenden Überblick über die morphologischen Merkmale unter einer selektiven neuronalen Population beobachtet zu schaffen. Die Kombination dieser Techniken stellt einen neuartigen Ansatz für die Sammlung und Analyse von Daten neuroanatomischen. Gemeinsam ermöglichen diese Techniken in großem Maßstab, und damit umfassendere, Probenahme selektiver neuronaler Populationen und unvoreingenommene quantitative Methoden etablieren zur Beschreibung morphologisch eindeutige neuronale Klassen innerhalb einer Population.
Das Protokoll beschreibt die Verwendung von modifizierten Tollwutvirus, selektiv Neuronen etikettieren. G-gelöscht Tollwut-Virus wirkt wie ein retrograden Tracers folgende stereotaktische Injektion in eine Zielgehirnstruktur von Interesse und dient als Vehikel für die Lieferung und die Expression von EGFP in Neuronen. Eine große Anzahl von Neuronen verwenden diese infiziertTechnik und Express GFP während ihrer Dendriten "Golgi-like" vollständige Füllungen von einzelnen Neuronen zu erzeugen. Dementsprechend verbessert sich die Virus-vermittelte retrograden Tracing Verfahren auf traditionelle farbstoffbasierte Rückverfolgungstechniken durch vollständige intrazelluläre Füllungen erzeugen.
Einzelne gut isolierte Neuronen quer durch alle Regionen des Gehirns untersuchten Bereich sind für den Wiederaufbau, um eine repräsentative Stichprobe von Neuronen zu erhalten ausgewählt. Das Protokoll beschreibt Verfahren Zellkörper zu rekonstruieren und dendritischen arborization Muster von markierten Neuronen über mehrere Gewebeschnitte vollenden. Morphologische Daten, einschließlich der Positionen jedes Neuron in der Gehirnstruktur, werden zur weiteren Analyse extrahiert. Standard-Programmierfunktionen wurden verwendet, um unabhängige Cluster Analysen durchzuführen und Cluster-Auswertungen auf Basis von morphologischen Metriken. Um die Nützlichkeit dieser Analysen statistische Auswertung einer Clusteranalyse perfo verifizierenRMED auf 160 Neuronen im Nucleus reticularis des Thalamus (TRN) von Makaken rekonstruiert wurde gemacht. Sowohl die ursprünglichen Cluster-Analyse und die statistischen Auswertungen hier durchgeführt zeigen, dass TRN Neuronen in drei Subpopulationen getrennt werden, jede mit einzigartigen morphologischen Eigenschaften.
Introduction
Neuroanatomie ist eine der Grundlagen der Neurowissenschaften 1 und aktuelle Interesse an der "connectomics" Begeisterung für das Verständnis der morphologischen Vielfalt neuronaler Populationen und die Verbindungen zwischen bestimmten Neuronen 2 erneuert. Verfahren zur Markierung und Rekonstruktion Neuronen stark mit den jüngsten Innovationen verbessert, einschließlich der genetischen und Virus-vermittelte Schaltung Tracing nähert 3, 4 und ermöglicht umfassendere morphologische Untersuchungen neuronaler Populationen 5. Neben Verbesserungen bei der Markierung einzelner Neuronen wurden quantitative Datenanalysetechniken entstanden auch , dass ermöglichen unabhängige und unvoreingenommene Klassifizierung von Neuronen in verschiedene Subpopulationen basierend auf morphologischen Daten 5, 6. Diese unvoreingenommene Techniken sind eine Verbesserung auf mehr traditional qualitative Klassifikationsverfahren, die den Standard im Bereich gewesen sind seit mehr als einem Jahrhundert. Das Ziel dieser Studie zu skizzieren ist, Schritt-für-Schritt wird die Kombination von virusvermittelten Kennzeichnung von Neuronen in einem selektiven Bevölkerung Groß Rekonstruktionen eines umfassenden Probe dieser Neuronen und quantitative Datenanalyse auf der Grundlage unabhängiger clustering mit statistische Auswertung. Durch die Kombination dieser Methoden beschreiben wir einen neuen Ansatz in Richtung auf die Sammlung und Analyse von Daten neuroanatomischen umfassenden Probenahme und unvoreingenommene Klassifizierung von morphologisch einzigartigen neuronalen Typen innerhalb eines selektiven neuronalen Population zu erleichtern.
Als ein Beispiel dieser Methoden beschreiben wir unsere Analyse einer großen Population von Neuronen innerhalb eines einzelnen Sektors des Nucleus reticularis (TRN) des Makaken-Affen. Diese Daten stammen aus einer früheren Studie 7. Verfahren zur selektiven Markierung von Neuronen TRN Projizieren auf die dorsale lateral geniculate Thalamuskern (dCGL) chirurgische Injektion von modifizierten Tollwutvirus mit EGFP kodiert , 4, 8 (siehe Tabelle spezifischer Materialien / Ausrüstung, Zeile 2) skizziert. Dieses modifizierte Tollwutvirus fehlt das Gen, das ein wesentlicher Hüllprotein kodiert, trans-synaptischen Bewegung des Virus zu eliminieren. Sobald das Virus Axonterminalen an der Injektionsstelle eintritt, wirkt es wie ein herkömmlicher retrograder Tracer mit dem wichtigen Vorteil der Fahr EGFP – Expression während der gesamten dendritischen arborization von infizierten Neuronen 5, 9, 10. Dementsprechend wurde dieser G-gelöscht Tollwutvirus selektiv genutzt werden, um zu infizieren und alle neuronalen Population beschriften der Injektion und retrograden Transport.
Um eine umfassende Analyse eines spezifischen neuronalen Population durchzuführen, ist es wichtig, aus zu probiereneine breite Verteilung von Neuronen in der Bevölkerung. Weil das Virus-vermittelte Markierungstechnik vollständige intrazellulär produziert ", Golgi-like" füllt vieler Neuronen mit Neuriten bei dem Virus Injektionsstelle ist es möglich, eine sehr große Stichprobe von Neuronen innerhalb des vollen Ausmaß einer Hirnstruktur zu rekonstruieren. Darüber hinaus, da das modifizierte Tollwutvirus zu infizieren und Beschriften große Anzahl von Neuronen, so wirksam ist, ist es möglich, Hunderte von Neuronen pro Tier zu rekonstruieren. Verfahren zur Probenahme 160 Neuronen im gesamten visuellen Sektor der TRN 11, um eine umfassende Stichprobe von dCGL ragende TRN Neuronen zu erzeugen , werden skizziert. Der Prozess einzelnen Neuronen der Rekonstruktion eines Neurons Rekonstruktionssystem mit einem Mikroskop, Kamera und Rekonstruktionssoftware beschrieben. Ebenfalls beschrieben sind Verfahren Positionen einzelner Neuronen innerhalb einer Hirnstruktur (in diesem Fall innerhalb des TRN) zu bestimmen, und der Virusinjektion sit zu überprüfene und ihren Standort innerhalb einer Struktur (in diesem Fall innerhalb der dCGL) Volumenkontur Rekonstruktionen. Schritte morphologischen Daten zu exportieren und unabhängige Cluster Durchführung von Analysen auf Basis von morphologischen Metriken für jedes Neuron gemessen beschrieben werden. Es gibt Einschränkungen Clusterverfahren und es gibt auch eine Vielzahl von verschiedenen Clustering-Algorithmen zur Verfügung. Dementsprechend diese Optionen und die Vorteile einiger der häufiger verwendeten Algorithmen werden beschrieben. Die Clusteranalyse liefert keine statistische Überprüfung der Eindeutigkeit von Clustern. Daher sind zusätzliche Schritte skizziert sowie optimale Clustering, um zu überprüfen, wie die Beziehungen zwischen den morphologischen Daten innerhalb und zwischen den Clustern. Statistische Methoden für die Cluster für die TRN-Datensatz bewerten, die TRN Neuronen zu bestätigen sind in drei einzigartige Cluster basierend auf 10 unabhängige morphologische Metriken beschrieben werden.
Somit wird durch Schritte zum selektiven Kennzeichnung umreißt, Rekonstruktion und morphologischen Daten aus einer bestimmten neuronalen Population zu analysieren, beschreiben wir Methoden für die innerhalb einer Population morphologische Unterschiede zwischen den Neuronen zu quantifizieren. Vor Ergebnisse verschiedener neuronaler Typen innerhalb des visuellen Bereichs des Makaken TRN mit separaten statistischen Auswertungsverfahren bestätigt. Gemeinsam hoffen wir, diese Techniken zu neuroanatomischen Datensätze breit anwendbar sein und dazu beitragen, quantitative Klassifizierung der Vielfalt neuronaler Populationen durch das Gehirn etablieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neuroanatomische Studien haben eine Säule der Neurowissenschaft und aktuelle Interesse an connectomics und Struktur-Funktionsbeziehungen blieb die Begeisterung für detaillierte morphologische Charakterisierung von selektiven neuronalen Populationen erneuert. Traditionell haben die neuroanatomische Studien über qualitative Einstufungen von Neuronen in morphologisch unterschiedliche Klassen von Neuronen, die durch Experten Neuroanatomen definiert verlassen. Mit den Fortschritten in den Techniken für Neuronen zu rekons…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Drs danken. Ed und Callaway Marty Usrey dafür, dass wir das Gewebe als Teil einer früheren Studie und Libby Fairless und Shiyuan Liu für die Hilfe bei der neuronalen Rekonstruktionen vorbereitet zu verwenden. und der Whitehall-Stiftung: Diese Arbeit wurde durch die NIH (EY018683 NEI) gefördert.
Materials
| SADΔG-EGFP | E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute | Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core | |
| Recording electrode: platinum/iridium or tungsten | FHC | UEPSGGSE1N2M | Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications |
| Nanoject II | Drummod Scientific | 3-000-204, 110V | Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe |
| Freezing microtome | Thermo Scientific | ||
| DAB | Sigma Aldrich | D5905-50TAB | 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen – must be bleached before discarding |
| Cytochrome C | Sigma Aldrich | C2037-100MG | |
| Catalase | Sigma-Aldich | C9322-5G | |
| Rabbit anti-GFP | Life Technologies/Thermo Fisher | #A-11122 | Primary antibody |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | #BA-1000 | Secondary antibody |
| Neurolucida System | MicroBrightField | Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida | |
| Neurolucida Explorer | MicroBrightField | Data export software | |
| Microfire Camera | Optronics | 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf | |
| Nikon E800 Microscope | Nikon Instruments Inc. | Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html | |
| Matlab | The MathWorks Inc. | Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Spreadsheet program |
References
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