다 능성 줄기 세포는 심근 수리를위한 심장 세포를 유도
Summary
우리는 심근 세포, 내피 세포, 평활근 세포 및 패치 – 매개 사이토 카인 배달 세포 주입을 조합함으로써 이식 된 세포의 생착을 향상 배송 방법으로 인간 유도 만능 줄기 세포를 구별하기위한 세 가지 신규하고보다 효율적인 프로토콜을 제안한다.
Abstract
인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)이 완전히 심근 (hiPSC-CMS), 내피 세포 (hiPSC-되는 EC), 및 평활근 세포 (SMCs)에 hiPSCs 차별화에 대한 관리 전에 특정 세포 유형,하지만 기존의 프로토콜로 분화해야합니다 자주 낮은 수율, 순도, 및 / 또는 가난한 표현형의 안정성에 의해 제한. 여기서는 신규 hiPSC-CM이, -ECs를 생성하기위한 프로토콜 및 -SMCs 실질적으로 종래의 방법보다 더 효율적이며, 물론 투여의 사이트를 통해 생성 된 사이토 카인 – 함유 패치 세포 주입을 조합하는 방법을 제시한다. 패치는 장기간 동안 인슐린 유사 성장 인자 (IGF)를 해제함으로써, 심근에서 압착되는 세포 않도록 바늘 트랙 및 세포 생존을 밀봉함으로써, 주입 된 세포의 보존을 모두 개선한다. 심근 허혈 재관류 손상의 돼지 모델에서 생착 속도가 클 때 두 배보다 더이었다세포는 세포 및 패치 모두 시토 킨 – 함유 패치없이 셀 비교 패치 및 치료 투여 아니라 단독 세포, 심장 기능 및 경색 크기에서 상당한 개선 연관되었다.
Introduction
들이 환자의 면역계에 의해 거부되지 않은 셀의 잠재적으로 무한 범위의 수로 구분 될 수 있기 때문에 유도 인간 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 재생 세포 치료에 가장 유망한 제제들이다. (SMCs을하지만, 자기 복제 및 분화 능력은 또한 종양 형성을 초래할 수 있으며, 결과적으로, hiPSCs 완전히 같은 심근 (CMS), 내피 세포 (EC에) 및 평활근 세포와 같은 특정 세포 유형으로 분화 될 필요 ), 투여 전. 세포 투여 간단하고 가장 일반적인 방법 중 하나는 직접 심근 내 주입이지만, 네이티브 심근 조직으로 이식 접목되는 세포의 수는 매우 낮다. 이 감소의 대부분은 허혈성 조직의 세포 독성 환경에 기인한다; 그러나, 생쥐 배아 줄기 세포 (는 ESC)가 있었을 때 손상되지 않은 마음의 심근에 직접 주입 O투여 된 세포의 상당한 비율이 그들이하는 동안 생성 된 높은 압력에 의해 바늘 트랙을 통해 압박했다 아마도 때문에 관리 사이트를 종료 제안 3-5 시간 1 일 동안 유지되었다 전달 된 5 백만 셀 할수 있답니다는 ~ 40 % 심근 수축.
여기, 우리는 hiPSC 유래 심근 세포 (hiPSC-CMS) 2, 내피 세포 (hiPSC-되는 EC) 3, 평활근 세포 (SMCs)을 4 생성 소설과 실질적으로 더 효율적인 방법을 제시한다. 특히,이 hiPSC-SMC 프로토콜은 주로 합성 또는 수축 SMC 표현형으로 세포를 연출하여 체세포 SMCs 5에서 관찰 형태 학적 및 기능적 특성의 넓은 범위를 모방 처음이다. 우리는 또한 사이토 카인 함유 피브린 (P)을 생성하여 주사 세포의 생착 속도를 향상 세포 전달 방법을 제공하는주사 부위를 통해 ATCH. 패치는 적어도 3 일에 걸쳐 인슐린 유사 성장 인자 (IGF)를 해제함으로써, 심근 종료로부터 세포를 방지 바늘 트랙 및 세포 생존을 밀봉함으로써, 두 세포 유지를 향상시키기 위해 나타난다.
Protocol
Representative Results
Discussion
hiPSC-CM이 향상된 수율 / 순도
의 CM으로 인간의 줄기 세포를 분화에 대한 기존의 프로토콜들은 종종 낮은 수율과 순도에 의해 제한된다 예를 들어, hESC의-CM이 단지 35-66% 느린 마이 오신 중쇄 또는 cTnT의 6 표현 퍼콜 분리 및 심장 몸 형성을 통해 획득했습니다. 분화 hiPSC-CM 인구의 순도는 대략의 프로모터에 결합되어 리포터 유전자의 발현을 위해 선택함으로써 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by US Public Health Service grants NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, and UO1 HL100407-project 4 (to JZ), an American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) and a Research Voucher Award from University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ).
Materials
| Protocol 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-ß | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-ß | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
 -aminocaproic acid |
Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
References
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