Pluripotent Kök Hücre Miyokard Onarım Kardiyak Hücreleri Türetilmiş
Summary
Biz kardiyomiyositlerde, endotel hücreleri ve düz kas hücreleri ve yama-aracılı sitokin teslimat hücre enjeksiyon birleştirerek nakledilen hücrelerin bütünleşmesini geliştiren bir dağıtım yöntemi, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin ayırt etmek için, üç yeni ve daha etkin protokollere sunuyoruz.
Abstract
İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (hiPSCs) tamamen kardiyomiyositlerde (hiPSC-CMS), endotel hücreleri (hiPSC-EC), ve düz kas hücreleri (SMC'lere) içine hiPSCs ayrıştırılması için uygulamadan önce, özel hücre tipleri, fakat geleneksel protokolleri ayırt edilmelidir genellikle düşük verim, saflık ve / veya zayıf fenotipik stabilitesi ile sınırlıdır. Burada, yeni hiPSC CMS, -ECs üretilmesi için protokoller ve -SMCs esas itibarıyla geleneksel yöntemlere göre daha verimli, hem de uygulama alanı üzerine oluşturulan bir sitokin içerikli bir flaster ile hücre enjeksiyonu birleştirmek için bir yöntem sunulmaktadır. Yama uzun bir süre boyunca insülin benzeri büyüme faktörü (IGF) serbest bırakarak, miyokard sıkılmış olan hücreler önlemek için iğne parça, ve hücre yaşamını mühürlenerek, enjekte edilen hücrelerin tutma hem de arttırır. miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarının domuz modelinde olarak bütünleşme oranı daha yüksek, iki kat daha fazla olduğunuHücreler hücreleri ve yama hem sitokin içeren yama olmadan hücrelere kıyasla yama ve tedavi ile uygulanmıştır, fakat tek başına hücreleri ile, kalp fonksiyonu ve infarkt önemli iyileşmeler ile ilişkilidir.
Introduction
onlar hastanın bağışıklık sistemi tarafından reddedilmesi olmayan hücrelerin bir potansiyel olarak sınırsız aralığı ve miktar içine ayırt edilebilir, çünkü insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) rejeneratif hücre tedavisi için en umut verici ajanlar arasında yer almaktadır. (SMC'lere Bununla birlikte, kendi kendine replikasyon ve farklılaşması için kendi kapasitesi, tümör oluşumuna neden olabilir ve bunun sonucunda, hiPSCs tamamen bu kardiyomiyositlerde (CMS), endotel hücreleri (EC), ve düz kas hücreleri gibi özel hücre tipleri, ayırt edilmesi gereken ), uygulamadan önce. Hücre yönetiminin en basit ve en yaygın yöntemlerden biri direkt intramiyokardiyal enjeksiyon, ancak yerli miyokard dokusu ile aşılanan nakledilen hücrelerin sayısı son derece azdır. Bu yıpratma çok iskemik doku sitotoksik ortamına bağlanabilir; Ancak, fare embriyonik kök hücreler (EKH) iken yaralanmamış kalplerin, myokarddan içine doğrudan enjekte ouygulanan hücrelerin önemli bir bölümünün onlar esnasında üretilen yüksek basınçlar tarafından iğne izi aracılığıyla sıkılmış, belki de yönetim sitesine çıkıldı düşündürmektedir 3-5 saat 1 için tutuldu teslim 5 milyon hücre nly ~ 40% miyokard kasılma.
Burada, hiPSC türetilmiş kardiyomiyositlerde (hiPSC CMS) 2, endotel hücrelerinin (hiPSC-EC) 3 ve düz kas hücreleri (SMC'lere) 4 oluşturmak için yeni ve büyük ölçüde daha etkili yöntemler sunar. Özellikle, bu hiPSC-SMC protokol ağırlıklı sentetik veya kontraktil SMC fenotip doğru hücreleri yönlendirerek somatik DKH'lerde 5 gözlenen morfolojik ve fonksiyonel özelliklerinin geniş taklit etmek ilk. Ayrıca, bir sitokin içeren fibrin s oluşturarak enjekte edilen hücrelerin melezleşmesi hızını artırır, hücre dağıtım için bir yöntem sağlarEnjeksiyon sitesi üzerinden atch. Yama, en az üç günlük bir süre boyunca insülin benzeri büyüme faktörü (IGF) serbest bırakarak, miyokard çıkan hücreler önlemek için iğne parça, ve hücre yaşamını mühürlenerek, her iki hücre tutmanın geliştirilmesi görünmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
hiPSC-CM'ler gelişmiş Verim / Saflık
CM'ler içine insan kök hücreleri farklılaştırarak için geleneksel protokoller genellikle düşük verim ve saflık ile sınırlıdır; Örneğin, hESC CM'ler sadece 35-66% yavaş miyozin ağır zincir ya da cTnT 6 dile Percoll ayrılması ve kardiyak vücut oluşumu yoluyla elde edilmiştir. Ayırt hiPSC-CM popülasyonlarının saflığı esasen promotere işlevsel olarak bağlanmış olan bir raportör geninin s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by US Public Health Service grants NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, and UO1 HL100407-project 4 (to JZ), an American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) and a Research Voucher Award from University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ).
Materials
| Protocol 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-ß | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-ß | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
 -aminocaproic acid |
Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
References
- Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
- Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
- Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
- Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
- Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
- Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
- Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
- Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
- Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
- Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
- Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
