Summary
Vi beskriver en protokol heri til isolering intakte øer fra neonatale mus. Pancreas blev delvist fordøjet med collagenase, efterfulgt af vask og hånd plukning. kan opnås 80 ø-klynger pr pancreas fra nyfødte mus, som er egnede til flere ø-undersøgelser - 20.
Abstract
Perfusion-baserede holm-isolation protokoller fra store pattedyr pancreata er veletablerede. Sådanne protokoller let udføres i mange laboratorier på grund af den store størrelse af pancreas kanalen, der giver mulighed for let collagenase injektion og efterfølgende vævsperfusion. I modsætning hertil holm isolation fra små pancreata, ligesom neonatale mus, er udfordrende, fordi perfusion ikke er let opnåelige i den lille pancreata. Her beskriver vi en detaljeret enkel procedure, der genvinder væsentligt antal øer fra nyfødte mus med visuel hjælp. Frisk dissekeret hele pancreas blev fordøjet med 0,5 mg / ml collagenase IV opløst i Hanks 'balancerede saltopløsning (HBSS) ved 37 ° C, i mikrocentrifugerør. Rør blev tappet regelmæssigt for at hjælpe væv spredning. Når det meste af vævet blev dispergeret til små klynger omkring 1 mm, blev lysater vasket tre til fire gange med dyrkningsmedium med 10% føtalt bovint serum (FBS). Islet klynger,blottet for genkendelige acinære væv, kan derefter udvindes under dissekere stereoskop. Denne metode genvinder 20 - 80 små til store og mellemstore øer pr bugspytkirtlen af nyfødte mus. Disse øer er egnet til de fleste tænkelige downstream assays, herunder insulin sekretion, genekspression, og kultur. Et eksempel på insulinsekretion assay præsenteres for validere isolation proces. Den genetiske baggrund og graden af fordøjelse er de største faktorer, der bestemmer udbyttet. Frisklavet collagenase løsning med høj aktivitet foretrækkes, da det aids i endokrin-eksokrin isolation. Tilstedeværelsen af kationer [calcium (Ca2 +) og magnesium (Mg2 +)] i alle opløsninger og føtalt bovint serum i vask / plukning medier er nødvendige for et godt udbytte af øer med korrekt integritet. En dissekere anvendelsesområde med god kontrast og forstørrelse vil også hjælpe.
Protocol
forbrug Animal følger procedurerne i protokol M / 11/181 godkendt af Vanderbilt Institutional Animal Care og brug Udvalg for Gu. CD1 eller CBA / BL6 mus blev indkøbt fra kommercielle leverandører og krydsede i Vanderbilt dyr mulighed for at opnå neonatale mus.
1. Udarbejdelse af mus, Stock Solutions, og udstyr
- For musen indlæg: oprette en mus kors og registrere plukker datoer for at hjælpe eksperimentel planlægning. CD1 mus normalt føder omkring dag 19 efter parring. Brug CD1 eller CBA / BL6 krydser at opnå CD1 eller CBA / BL6 nyfødte hhv. Krydsninger mellem de to linjer udnytte CD1 hunner og CBA / BL6 hanner.
- For collagenase lager: vejer 200 mg collagenase type IV med en høj præcision balance. Overførsel til en 50 ml centrifugerør. Opløses i 40 ml HBSS med Ca 2+ / Mg2 + (1,26 og 0,5 mM) til fremstilling af en 5 mg / ml stamopløsning.
- Tillad collagenase tilopløses for ~ 30 min med forsigtig rystning. Alikvot og opløsningen opbevares nedfrosset i -20 ° C som lager, som forbliver aktiv i mindst et år.
- Autoklaver at sterilisere flere par pincet, saks og P20 tips til dissektion og islet plukning.
- For 1 M glucose lager: Afvej 9 g glucose i en 50 ml centrifugerør, tilsættes 50 ml RPMI 1640-medier til at opløse glucose. Opbevares i 4 ° C indtil anvendelse, men ikke mere end 6 måneder.
2. Arbejdsvilkår Solutions
BEMÆRK: Dagen for holmen isolation, forberede følgende reagenser.
- For collagenase type IV brugsopløsning: tø og fortynd collagenase lager på is. Dispensér 0,15 ml lager i hver 1,7 ml mikrofugerør. Tilføj 1,35 ml HBSS med Ca 2+ / Mg2 +. Vend røret 5 gange. Lad på is i 15 min.
- Spin ved høj hastighed i 3 minutter i en mikrocentrifuge. Overfør supernatanten til et nyt rør. Efterlad på is indtil anvendelse. Kassér rør med uopløselige rester.
- For fuldstændig RPMI 1640 medier: tilføje 2,5 ml 1 M glucose, 50 ml varmeinaktiveret FBS, og 5 ml 100x Pen-strep lager i 500 ml RPMI 1640-medier. Efterlad på is indtil brug.
3. Pancreas Isolering og fordøjelse
- Afliv nyfødte med isofluran, efterfulgt af halshugning henhold til godkendte protokoller.
- Læg musen med sin mave opad. Spray med 70% ethanol til sterilisering.
- Løft maveskindet op med en pincet og skære huden og muskellag længderetningen langs midterlinien med en saks, fra det genitale område til brystkassen. Dette åbner bughulen for at eksponere alle indre organer.
- Overføre alle de indre organer til en 100 cm skål med en pincet. Find bugspytkirtlen, som er en spredt-orgel med en dorsal del, der klamrer sig til maven og milt og en ventral del, der klamrer sig til tolvfingertarmen 11. Tilføj HBSS i fadet at oversvømme organer. I opløsning, pancreas væv ikke længere klynger sig til duodenum, mave, eller milt. Det er let genkendelige under et dissekere omfang på grund af dens typiske hvide farve. Brug en pincet til at skrælle pancreas væv væk fra omgivende væv og overførsel til en ny 60 mm skål med HBSS.
- Skær hver bugspytkirtlen med en saks i stykker mindre end 5 mm på tværs eventuelle dimensioner. Overførsel til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Op til fem pancreas (yngre end P7) kan fordøjes i et rør. For P8-P16 mus, bruge et rør pr bugspytkirtlen.
- Tilsæt 0,5 - 1 ml collagenase arbejder opløsning til hvert rør (0,2 ml for hver P1-P7 bugspytkirtlen Brug 0,5 ml for hver P8-P16 pancreas.). Efterlad røret i et 37 ° C inkubator i op til 15 min. Vend røret to gange hver min.
- Efter ~ 5 min, tryk på røret for at overvåge fordøjelsen status pancreas væv. Fortsæt nedbrydningsprocessen, indtil det meste af den pancreatiskevæv vises som fragmenterede celleklynger, med en diameter på <2 mm. Lysatet vises overskyet, hvilket skyldes normal acinære celle autolyse.
4. Lysat Vask
- Spin lysatet ved 500 xg i 10 s i en mikrocentrifuge. Fjern supernatanten lag med en P1,000 Pipetman. Supernatanten skal vises uklar, men blottet for celleklynger. Brug ikke aspiration, som hurtigt kan aspireres væk vævsfragmenterne i bunden på grund af tilstedeværelsen af nogle sticky DNA.
- Tilsæt 1 ml RPMI 1640 komplet medier. Tryk røret forsigtigt at opblande fragmenterede lysat. Invert op og ned 10 gange. Gentag trin 4.1.
- Gentag trin 4.2 to gange mere, eller indtil supernatanten synes klar. Re-suspendere vaskede pancreas fragmenter i 1 ml komplet RPMI 1640 medier.
5. Islet Isolation
BEMÆRK: For små antal pancreas, direkte hånd-picking som nedenfor (5.1) kan anvendes til ø-isolation. For store antal af pancreas (> 6), metoden i 5,2 foretrækkes.
- Direkte hånd-picking:
- Overfør lysatet fra trin 4.3 til en 60 mm skål. Tilsæt 5 ml komplet RPMI 1640-medier. Bring under et dissektionsmikroskop.
- Opsæt den lyse felt belysning på mikroskopet. Juster lysintensiteten til ~ 50% af den maksimale effekt. Under denne betingelse, synes holme som lidt lyserøde klynger, mens acinære celler som mørke uregelmæssigt formet klynger (figur 1A). En forstørrelse på ~ 50X (kombinere kraften af målet og øjet stykke) anbefales at tilbyde den bedste måde at visualisere holme og pipettespidsen åbning samtidigt til plukning.
- Saml holme med en P20 pipettespids samtidig undgå acinære klynger. Dispensere øer beriget fraktioner til en ny 60 mm skål med RPMI komplette medier (figur 1B).
- Gentag hånd-picking processen to gange mere. Lad rene holme i en ny 60mm skål med 4 ml komplet RPMI-medium (figur 1C).
- Gradientcentrifugering:
- Der fremstilles en 15 ml centrifugerør, der er indlæst med 2 ml polysucrose og natrium diatrizoat med en densitet på 1,077 g / ml. Efterlad røret på is indtil brug.
- Overfør suspensionen fra trin 4.3 på toppen af polysucrose og natrium diatrizoat opløsning med en Pasteur-pipette. Forstyr ikke det nederste lag. Væv fra op til 10 nyfødte eller 2 P17 pancreas kan indlæses i hver 15 ml rør.
- Spin røret ved ~ 600 xg i en gynge rotor i 15 minutter ved 4 ° C. Brug bremse-off indstillinger.
- Efter centrifugering, overføre medierne og interfase lag (bemærk, at under ideelle driftsforhold, vil øerne være placeret i interfasen mellem polysucrose og dyrkningsmedier efter centrifugering) i en ny 15 ml rør. Tilsæt 10 ml medier, bland forsigtigt, men grundigt.
- Spin ned holmen fraktionved 300 xg i 5 min. Fjern vask medier. Gentag vask en gang mere med komplet RPMI-medium. Resuspender pellets i til 4 ml medier, der indeholder det meste holme og kanaler (Figur 1D).
- Håndplukke de holme, som beskrevet i afsnit 5.1.
6. GSIS Analyser i isolerede Islets
- Inkuber øerne fra trin 5.1.4 i komplet RPMI-medium i 2 timer i en 37 ° C vævsdyrkningsinkubator.
- Brug en pipette til at fjerne RPMI under et dissektionsmikroskop. Tilsæt 3 ml KRB-opløsning med 2,8 mM glucose til pladen 3. Swirl 10 gange for at vaske øerne. Fjern KRB løsninger.
- Gentag vaskeprocessen gang. Inkuber øerne med 3 ml KRB-opløsning ved 37 ° C i 1 time i en inkubator.
- Aliquot 1 mL KRB i hver brønd i en plade med 12 brønde. Pre-varme KRB lager og pladen til 37 ° C i en inkubator.
- Vask holme to gange med forvarmet KRB som i 6.2. Transfer 10 holme til hver brønd af forvarmet plader. Inkuber i en 37 ° C inkubator.
- Efter 45 min, trække 50 pi supernatant. Dette indeholder insulinopløsningen udskilles under basal glukose.
- Tilføj 32 pi 500 mM glucose. Swirl pladen 20 gange for at blande opløsningen. Inkuber i en 37 ° C inkubator. Swirl pladen 5 gange en gang hver 5 min.
- Efter 45 min, trække 50 pi supernatant. Dette er den insulin udskilles under højt glukose.
- Overfør alle øer til et 1,5 ml rør. Frys i -20 ° C i 30 minutter. Tø op ved stuetemperatur i 5 min. Gentag nedfrysning og optøning proces.
- Tilsæt 0,5 ml 70% ethanol med 20 mM HCI. Lad natten over. Dette er den insulin tilbage i øer.
- Brug konventionel ELISA til analyse insulin niveauer, beskrevet tidligere 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under optimale betingelser, kan den foreliggende fremgangsmåde udbytte 20 - 80 øer fra hver lille mus pancreas. Dette nummer er afhængig af den genetiske baggrund, alder af mus, og størrelsen af holme, der skal inddrives. Blandt de almindeligt anvendte, CD1 ud-avlet og C57BL / 6J racerene mus producerer mindre holme med mindre størrelse end hybrider mellem CD1 og C57BL / 6 eller kommerciel B6CBAF1 / J-mus gør. Direkte hånd plukke generelt gav et mindre antal øer, sandsynligvis på grund af udelukkelsen af små øer, som kunne være svært at indregnes, når det blandes med eksokrine væv (figur 1A-C). Gradientcentrifugering kan give flere øer, herunder mindre øer i blandingen (figur 1 D). Ældre mus producerer også flere og større holme, som forventet fra fortsatte holm spredning efter fødslen. Interessant er holmen nummer inddrives ikke direkte korreleret med bugspytkirtlen størrelse: CD1 mus har normalt større bugspytkirtlen end F1 progenies af CD1 og C57BL / 6J mus krydser. Endnu CD1 mus normalt producerer færre øer end F1 afkom.
Enten insufficient- eller over-fordøjelse med collagenase resultater i suboptimal ø isolation. I førstnævnte tilfælde kan store øer let visualiseres, men nogle øer ikke kan adskilles fuldstændigt fra acinære væv (figur 2A). Dette vil reducere udbyttet af øer, men større øer produceres normalt. I sidstnævnte tilfælde kan acinære væv helt adskilles fra holme. Men det kompromitterer holmen struktur, hvilket resulterer i mange holme med ru overflader (Figur 2B).
Neonatale øer isoleret ved denne fremgangsmåde have forventet insulinsekretion profiler. For eksempel, både P1 og P7 holme viste høj basal insulin sekretion (figur 3, sammenligne niveauet af insulinsekretion på 2,8 mM glucose between P1-P7 og modne P24 øer), typiske GSIS profiler af umodne ø betaceller 7, 9. Dette antyder, at vores islet isolation proces i høj grad bevarer de funktionelle egenskaber af neonatale øer. Vi forventer derfor, at disse øer sandsynligvis egnet til andre in vitro baserede undersøgelser, herunder genekspression, metaboliske analyser, overlevelse analyser, og stressreaktioner.
Figur 1. Udseende af Islets under isolationsprocessen. (A) P1 pancreas efter collagenase fordøjelse. Pil peger på en relativt stor ø. Pilehoveder peger på to relativt små holme. (B) P1 holme efter første runde hånd-picking. (C) Islets efter 3. runde handpicking. (D) Islet fraktioner efter gradientcentrifugering. Pil, en stor ø. Arrowhead, enlille holm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Islets efter Insufficient- eller Over- fordøjelse med collagenase. (A) Håndplukket øer efter under-fordøjelse, bemærk sammenhængen mellem nogle holme (pink klynger, pile) og acinære celler (mørke klynger, pilespidser). (B) holme efter over-fordøjelse, bemærk holme med takkede overflader (pile). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. GSIS Results fra isolerede holme. Præsenterede data er gennemsnit ± SEM. De repræsenterer procentdelen af insulinfrigørelse (mængde insulin frigives over den totale mængde insulin, der er indeholdt i startende øvævsceller) inden for en 45 min assay vindue med angivne glucosekoncentration. Islets fra ICR-mus, via direkte hånd plukning, blev anvendt til disse assays. Bemærk, at P1 og P7 holme blev anset umodne, mens P24 holme er modne 7, 9. P-værdierne beregnes mellem grupper under anvendelse t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her giver vi en trin-for-trin-protokollen på holm isolation fra pancreata der er for små til konventionel perfusion. Det forventes at give øer klar til alle ø-baserede undersøgelser såsom beta-celle oprensning, genanalyse, ø-beta-celle modning, proliferation, cell stressreaktioner, celleoverlevelse, metabolisme og funktionel GSIS vedligeholdelse osv. Dette vil være til vores bedste overbevisning er de første detaljerede visuelle protokol, der guider nye forskere til at udføre ø isolation fra neonatale mus. Uden disse visuelle hjælpere, forventes omfattende trial and error for de fleste forskere at opnå succes holm isolation fra små pancreata.
Det mest kritiske faktor for en vellykket islet isolation er den rette grad af pancreas fordøjelse som beskrevet i trin 3.6 - 3.8. Generelt både under- og over-fordøjelse reducere holm udbytte. Over-fordøjelse yderligere kompromiser ø arkitektur, der makes dem uegnede til funktionelle assays. For at opnå de bedste fordøjelse resultater, reaktionen skal overvåges konstant at visualisere vævet fragmentering processen. Optælling på varigheden af fordøjelsen til at bedømme acinære-holmen adskillelse er den mindst pålidelig metode, fordi hver batch af collagenase er anderledes og alder / størrelse startende bugspytkirtlen dybtgående måde påvirker fordøjelsen proces. I tilfælde af under-fordøjelse kan store endokrine-eksokrin klynger vaskes i HBSS og fordøjet igen med collagenase. Fordøjelsen kan derefter overvåges direkte under et dissektionsmikroskop for at bestemme tidspunktet for fortsat fordøjelse. Forsigtig pipettering kan også anvendes til at aide væv dissociation. I dette tilfælde skal en P1,000 spids med bred åbning behov udnyttet, hvilket mindsker forskydningskraften, der kunne ødelægge holmen arkitektur. Over-fordøjet øer ikke anbefales til de fleste efterfølgende studier, men kan anvendes til nogle assays, såsom genekspression analyse med careful kontroller.
Udover ovenstående forsigtighed, opmærksomhed på flere proceduremæssige faktorer kan yderligere forbedre den endelige holm udbytte og kvalitet. Først Ca 2+ og Mg 2+ bør indgå i alle løsninger, hvis ikke-kommercielle kilder blev udnyttet. Disse kationer er nødvendige for at opretholde holm integritet. Sekund, frisk collagenaseopløsning med høj aktivitet er vigtig. Collagenase løsning med lave aktivitet resulterer i en længere tid til væv dissociation. Dette forårsager betydelig eksokrine celle autolyse og holmen ødelæggelse. Til dette formål, udnytte collagenase- aktier med mere end tre runder af frysning-optøning anbefales ikke. Tredje, centrifugering ved lav hastighed under væv vask anbefales. Den tommelfingerregel er at bruge ag kraft (<500 xg), som er tilstrækkelig til at sedimentere cellen klynger mens opretholde celle debris i supernatanten i trin 4.1 i protokollen. Denne hastighed ikke kun undgår at ødelægge holme, men også hjælper til Remove celledebris at muliggøre lettere islet visualisering under hånden plukning. Endelig kan collagenase ikke inaktiveres ved serum 12. Således dens fjernelse ved vask er vigtigt at sikre ø integritet i senere undersøgelser.
Endelig skal det bemærkes, at den præsenterede protokol bør begrænses til mus pancreas fra P1 til P17. Det virker ikke godt for pancreata ældre end P18. Konventionel perfusion for disse ældre mus anbefales til et bedre udbytte og sundere holme. Desuden den genetiske baggrund og alder af mus dybt påvirke holmen udbytte 13,14. Derfor vil selv optimale betingelser giver forskellige antal øer pr bugspytkirtlen, som er normal og forventet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1x HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with subsequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
References
- Matsumoto, S., et al. Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation. Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Zhao, A., et al. Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells. Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).
- Planas, R., et al. Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes. Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).
- Tonne, J. M., et al. Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy. Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).
- London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).
- Rorsman, P., et al. Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).
- Hellerstrom, C., Swenne, I. Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells. Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).
- Blum, B., et al. Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
- Hegre, O. D., et al. Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans. In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).
- Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e102445 (2015).
- White, J., White, D. C. Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes. , C.R.C. Press. (1997).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).
- Bouwens, L., Rooman, I.
