Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.
Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models.
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.
L'obésité est un problème de santé en plein essor dans les pays développés et en développement. Il a été rapporté comme étant l' une des conditions coexistant fréquemment associés à la stéatose non alcoolique du foie (stéatose hépatique non alcoolique), avec une prévalence variant entre 30 et 100 pour cent chez les patients NAFLD 1. En raison de la forte corrélation entre le foie gras et l' obésité, (DIO) modèles induits par l' alimentation de souris obèses sont largement utilisés pour étudier les mécanismes moléculaires complexes associés au développement de NAFLD 2, 3, 4, 5, 6. La stéatose hépatique est la première étape de NAFLD, et il peut évoluer vers la stéatohépatite non alcoolique (NASH), la cirrhose, et finalement, un cancer du foie 7. Par conséquent, l'objectif global de cette méthode est de générer des modèles animaux et cellulaires des conditions stéatosiques hépatiques et de provide protocoles détaillés pour la mesure des lipides efficace et précis. Ces modèles et mesures sont également utiles pour l'étude d'autres troubles métaboliques, tels que la résistance à l'insuline et le diabète de type 2.
Comme l'obésité est identifiée comme l'un des principaux facteurs de risque pour la SHNA, une haute teneur en matières grasses, de haute-sucrose alimentation (HFHS) qui imite le style occidental régime riche en graisses est utilisé pour induire l'obésité chez les souris. Par la suite, le degré de stéatose hépatique peut être évaluée à l'aide de différentes méthodes. Tout d'abord, le poids corporel et de l'analyse de la composition corporelle avec la résonance magnétique nucléaire (RMN) montrent l'accumulation de lipides pendant l'heure du repas. La masse grasse et la masse maigre peuvent être quantifiés de façon non invasive et en temps réel.
En outre, l'imagerie par résonance magnétique (IRM) est utilisée pour montrer à la fois l'ensemble du corps et de la répartition du foie de la graisse. Le signal de niveau de gris de l'analyse de l'IRM peut être convertie en une image lisible en pseudo-couleurs, et l'intensité dele niveau de gris et la couleur est hémi-quantifiable. Cette technologie offre des avantages uniques pour la mesure de l'accumulation des lipides dans les animaux vivants. Deuxièmement, l'analyse histologique du foie est la méthode la plus couramment utilisée pour déterminer la stéatose hépatique. Hématoxyline et à l'éosine (H & E) fournit des informations de coloration histologique, comme une morphologie hépatocytaire et l'infiltration des macrophages, tandis que l'huile rouge O coloration indique la taille et la position des gouttelettes lipidiques dans les hépatocytes. En troisième lieu, l'analyse de la teneur en lipides par extraction au chloroforme / méthanol est une mesure précise et quantitative des lipides hépatiques. Total des taux de triglycérides et de cholestérol peuvent être mesurés avec des méthodes biochimiques. Fait important, l'analyse de l'extraction des lipides et à l'huile rouge O coloration peuvent également être utilisés dans génétiquement manipulées ou traitées pharmaceutiquement hépatocytes.
L'avantage du présent procédé est son utilisation d'approches multiples optimisées pour générer des modèles de stéatose hépatiqueet de caractériser complètement les phénotypes in vivo et in vitro. Les modèles DIO de souris peuvent récapituler les pathologies métaboliques et phénotypes de la maladie du foie gras humain. D' autres paramètres métaboliques chez l' homme peuvent être reproduits dans ce modèle ainsi 8. La génération du modèle d'hépatocytes stéatosique en réponse à glucose élevé, plus l'insuline est efficace, utile, et surmonte la limitation des travaux coûteux et fastidieux souris. Pris ensemble, ces méthodes sont suffisantes et indispensables pour l'étude de la dysfonction hépatique des lipides et de la résistance à l'insuline lors de la surcharge des éléments nutritifs.
NAFLD est une série de maladies hépatiques progressives qui est associée au syndrome métabolique, l' obésité, la résistance à l'insuline, ou diabète de type 2 (DT2) 11. La caractéristique de NAFLD est stéatose, l'accumulation de lipides dans les hépatocytes. Ici, un éventail de méthodes est présentée pour caractériser les phénotypes et les paramètres de la stéatose hépatique utilisant des souris DIO et les hépatocytes primaires de souris. Cette procédure pourrai…
The authors have nothing to disclose.
We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.
O.C.T compound | SAKURA | 4583 | |
Oil Red O | Sigma | O0625-25G | |
Infinity Triglycerides kit | Fisher Scientific | TR22421 | |
Infinity Cholesterol kit | Fisher Scientific | TR13421 | |
Collagen type I, Rat tail | Millipore | 08-115 | |
DMEM (low glucose) | Invitrogen | 11885-092 | |
Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
FBS | Invitrogen | 10099141 | |
PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1mM for stock |
Glucose | Sigma | G8270-100G | |
Microscope | Olympus | BX53 | |
Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
10cm cell culture dish | Corning | 420167 | |
6-well-plate | Corning | 3516 | |
BCA assay | Beyotime | P0010 | |
Nuclear Magnetic Resonance | Niumag technology | MiniQMR23-060H-I | |
High fat high surcose diet(HFHS) | Research Diets | D12327 |