Optimize Analizi<em> İn Vivo</em> ve<em> İn Vitro</em> Karaciğer Steatoz
Summary
Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.
Abstract
Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models.
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.
Introduction
Obezite gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde gelişen bir sağlık sorunudur. NAFLD hastalarda 1 yüzde 30 ila 100 arasında değişen bir prevalansı, sıklıkla alkol kaynaklı olmayan yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) ile ilişkili birlikte bulunan koşullardan biri olduğu bildirilmiştir. Nedeniyle karaciğer yağlanması ve obezite arasında güçlü ilişki nedeniyle, diyete bağlı obez (DIO) fare modelleri yaygın NAFLD 2, 3, 4, 5, 6 gelişimi ile ilişkili karmaşık moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılır. Hepatik steatoz NAFLD en erken aşamasıdır ve alkolsüz steatohepatit (NASH), siroz, ve sonuçta karaciğer kanseri 7 ilerleyebilir. Bu nedenle, bu yöntemin genel amacı karaciğer yağlanmış koşulların hayvan ve hücre modelleri oluşturmak ve pr içinverimli ve doğru lipit ölçümü için ovide ayrıntılı protokoller. Bu modeller ve ölçümleri de, insülin direnci, tip 2 diyabet gibi başka metabolik bozuklukların araştırılması için de yararlıdır.
obezite NAFLD, yüksek yağ faktörlerinden biri olduğu tespit gibi, yüksek sakarozlu diyet ile Batı tarzı yüksek yağlı diyet taklit (HFHS) farelerde, obezıteyi uyarmak için kullanılır. Daha sonra, hepatik steatoz derecesi farklı yöntemler kullanılarak değerlendirilebilir. İlk olarak, vücut ağırlığı ve nükleer manyetik rezonans (NMR), vücut kompozisyonu analizi zaman beslenme sırasında lipid birikimini gösterir. yağ kütlesi ve yağsız kitle non-invaziv ve gerçek zamanlı bir şekilde belirlenebilir.
Buna ek olarak, manyetik rezonans görüntüleme (MRG) tam vücut ve yağ karaciğer dağılımını hem göstermek için kullanılır. MR analizi gri tonlama sinyali okunaklı sözde renkli görüntüye dönüştürülür ve yoğunluğunun edilebilirgri tonlama ve renk hemi-ölçülebilir olduğunu. Bu teknoloji, canlı hayvanlarda lipid birikimi ölçümü için benzersiz avantajlar sağlamaktadır. İkinci olarak, karaciğerin histolojik analiz hepatik steatoz belirlemek için en sık kullanılan yöntemdir. Oil Red O boyama hepatositlerde lipid damlacıklarının boyutunu ve konumunu gösterirken Hematoksilen ve Eosin (H & E) boyama gibi hepatosit morfolojisi ve makrofaj infiltrasyonu olarak histolojik bilgi sağlar. Üçüncü olarak, kloroform / metanol ekstraksiyonu kullanılarak lipid içeriği analizi hepatik lipid doğru ve kantitatif ölçüsüdür. Toplam kolesterol ve trigliserid düzeyleri biyokimyasal yöntemler ile ölçülebilir. Önemli bir şekilde, lipit ekstraksiyon analizi ve Yağ Kırmızı O boya aynı zamanda genetik olarak manipüle ya da farmasötik açıdan kabul hepatositlerde kullanılabilir.
Bu yöntemin avantajı, karaciğer yağlanmış modelleri oluşturmak için birden fazla optimize yaklaşımların kullanılmasıdırve kapsamlı in vivo ve in vitro olarak, her iki fenotipleri karakterize etmek. DIO fare modelleri insan yağlı karaciğer hastalığının patolojisi ve metabolik fenotipleri özetlemek olabilir. İnsanlarda Diğer metabolik parametreler kuyu 8 olarak bu modelde çoğaltılmış olabilir. yüksek glukoz artı insülin yanıt olarak yağlanmış hepatosit modelinin oluşturulması yararlı verimli ve pahalı ve zaman alıcı bir fare çalışmanın sınırlama üstesinden gelir. Birlikte ele alındığında, bu yöntemler, bir besin yüklenme sonucu hepatik lipid bozukluğu ve insülin direnci çalışma için yeterli ve gereklidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
NAFLD metabolik sendrom, obezite, insülin direnci, ya da tip 2 diabetes mellitus (T2DM) 11 ile ilişkili olan ilerleyici karaciğer hastalıklarının bir dizi. NAYKH'nın damgasını yağlanma, hepatositlerde lipid birikimidir. Burada, yöntemler spektrum fenotipleri ve DIO fare ve fare primer hepatositlerde kullanarak hepatik steatoz parametrelerini tanımlamak için sunulmuştur. Bu prosedür NAYKH ve diğer ilgili metabolik hastalıkların moleküler mekanizmaları aydınlatmak için yar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.
Materials
| O.C.T compound | SAKURA | 4583 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625-25G | |
| Infinity Triglycerides kit | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Infinity Cholesterol kit | Fisher Scientific | TR13421 | |
| Collagen type I, Rat tail | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (low glucose) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1mM for stock |
| Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| 10cm cell culture dish | Corning | 420167 | |
| 6-well-plate | Corning | 3516 | |
| BCA assay | Beyotime | P0010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance | Niumag technology | MiniQMR23-060H-I | |
| High fat high surcose diet(HFHS) | Research Diets | D12327 |
References
- Angulo, P. Medical progress – Nonalcoholic fatty liver disease. New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).
- Chen, X., et al. Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha. Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).
- Li, Y., et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).
- Li, Y., et al. Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21. Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).
- Esau, C., et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).
- Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).
- Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. Human fatty liver disease: old questions and new insights. Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).
- Hebbard, L., George, J. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).
- Chen, Y., et al. Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier. Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).
- Gong, Q., et al. Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice. Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).
- Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).
