تحليل الأمثل ل<em> في فيفو</em> و<em> في المختبر</em> كبدي تشحم
Summary
Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.
Abstract
Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models.
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.
Introduction
السمنة مشكلة صحية المزدهرة في البلدان المتقدمة والنامية. تم الإبلاغ عن أن تكون واحدة من شروط التعايش كثيرا ما يرتبط مع غير الكحولي مرض الكبد الدهني (NAFLD)، مع انتشار تتراوح بين 30 و 100 في المئة في المرضى الذين يعانون NAFLD 1. ويرجع ذلك إلى ارتباط قوي بين الكبد الدهني والسمنة، وتستخدم يعانون من السمنة المفرطة (ديو) نماذج الماوس التي يسببها النظام الغذائي على نطاق واسع لدراسة الآليات الجزيئية المعقدة المرتبطة تطوير NAFLD 2، 3، 4، 5، 6. تشحم الكبد هو أول مرحلة من NAFLD، وأنها يمكن أن تتطور إلى التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (ناش)، تليف الكبد، وفي نهاية المطاف، سرطان الكبد 7. ولذلك، فإن الهدف العام من هذه الطريقة لتوليد الحيوانات والخلايا نماذج من الظروف steatotic الكبدية والعلاقات العامةبروتوكولات وإجراءات تفصيلية أوفيد لقياس الدهون كفاءة ودقة. هذه النماذج والقياسات هي مفيدة أيضا للتحقيق في الاضطرابات الأيضية الأخرى، مثل مقاومة الأنسولين وداء السكري من النوع 2.
كما تم تحديد السمنة لتكون واحدة من عوامل الخطر الرئيسية للNAFLD، ونسبة عالية من الدهون، ويستخدم عالية السكروز النظام الغذائي (HFHS) أن يقلد على النمط الغربي عالية من الدهون نظام غذائي للحث على السمنة في الفئران. وفي وقت لاحق، ودرجة تشحم الكبد يمكن تقييم باستخدام أساليب مختلفة. أولا، ووزن الجسم وتحليلها وتكوين هيئة من الرنين المغناطيسي النووي (NMR) تظهر تراكم الدهون خلال فترة الرضاعة. كتلة الدهون والكتلة الخالية من الدهن يمكن قياسها بطريقة غير الغازية وفي الوقت الحقيقي.
وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) لإظهار كل من الجسم كله، وتوزيع الكبد من الدهون. إشارة الرمادي لتحليل التصوير بالرنين المغناطيسي يمكن تحويلها إلى مقروءا الصورة الزائفة اللون، وشدةوالرمادي واللون هو-نصفي للقياس الكمي. توفر هذه التقنية مزايا فريدة لقياس تراكم الدهون في الحيوانات الحية. ثانيا، التحليل النسيجي للكبد هو الأسلوب الأكثر شيوعا لتحديد تشحم الكبد. يوفر الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ المعلومات النسيجية، مثل التشكل الكبدية وتسلل بلعم، في حين يظهر النفط الأحمر يا تلطيخ حجم وموضع من قطرات الدهون في خلايا الكبد. ثالثا، تحليل محتوى الدهون باستخدام استخراج الكلوروفورم / الميثانول هو القياس الدقيق وكمية من الدهون الكبدية. ويمكن قياس مجموع مستويات الدهون الثلاثية والكوليسترول مع أساليب الكيمياء الحيوية. الأهم من ذلك، تحليل استخلاص الدهون والزيوت الأحمر يا تلطيخ يمكن أن تستخدم أيضا في معالجة جينيا أو صيدلانيا تعامل خلايا الكبد.
وميزة هذا الأسلوب هو استخدامه من النهج الأمثل متعددة لتوليد نماذج steatotic الكبديةولتوصيف شامل الظواهر سواء في المجراة في المختبر. يمكن للنماذج DIO الماوس ألخص في علم الأمراض والتمثيل الغذائي الظواهر من مرض الكبد الدهني البشري. المعلمات الأيضية الأخرى في البشر يمكن تكرارها في هذا النموذج، وكذلك 8. توليد نموذج الكبدية steatotic ردا على ارتفاع نسبة الجلوكوز بالإضافة إلى الأنسولين هو فعالة ومفيدة، ويتغلب على الحد من عمل الماوس مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. معا، وهذه الأساليب هي كافية وضرورية لدراسة الخلل الدهون الكبدية ومقاومة الأنسولين خلال الحمولة الزائدة من المغذيات.
Protocol
Representative Results
Discussion
NAFLD هو عبارة عن سلسلة من أمراض الكبد التقدمية التي ترتبط مع متلازمة التمثيل الغذائي، والسمنة، ومقاومة الأنسولين، أو من النوع 2 من مرض السكري (T2DM) 11. السمة المميزة لNAFLD هو تنكس دهني، وتراكم الدهون في خلايا الكبد. هنا، يتم تقديم مجموعة متنوعة من الأساليب لتو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.
Materials
| O.C.T compound | SAKURA | 4583 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625-25G | |
| Infinity Triglycerides kit | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Infinity Cholesterol kit | Fisher Scientific | TR13421 | |
| Collagen type I, Rat tail | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (low glucose) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1mM for stock |
| Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| 10cm cell culture dish | Corning | 420167 | |
| 6-well-plate | Corning | 3516 | |
| BCA assay | Beyotime | P0010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance | Niumag technology | MiniQMR23-060H-I | |
| High fat high surcose diet(HFHS) | Research Diets | D12327 |
References
- Angulo, P. Medical progress – Nonalcoholic fatty liver disease. New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).
- Chen, X., et al. Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha. Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).
- Li, Y., et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).
- Li, Y., et al. Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21. Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).
- Esau, C., et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).
- Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).
- Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. Human fatty liver disease: old questions and new insights. Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).
- Hebbard, L., George, J. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).
- Chen, Y., et al. Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier. Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).
- Gong, Q., et al. Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice. Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).
- Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).
