के अनुकूलित विश्लेषण<em> Vivo</em> और<em> इन विट्रो</em> यकृत steatosis
Summary
Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.
Abstract
Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models.
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.
Introduction
मोटापे की वजह से विकसित और विकासशील देशों में बढ़ती स्वास्थ्य समस्या है। यह 30 और 100 NAFLD रोगियों 1 में प्रतिशत के बीच लेकर एक व्यापकता के साथ, coexisting की स्थिति अक्सर nonalcoholic फैटी लीवर रोग (NAFLD) के साथ जुड़े में से एक होने की सूचना दी गई है। फैटी लीवर और मोटापे के बीच मजबूत संबंध के कारण, आहार प्रेरित मोटापे से ग्रस्त (DIO) माउस मॉडल व्यापक रूप से NAFLD 2, 3, 4, 5, 6 के विकास से जुड़े जटिल आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। यकृत स्टीटोसिस NAFLD के प्रारंभिक चरण है, और यह nonalcoholic स्टीटोहैपेटाइटिस (नैश), सिरोसिस, और अंत में, लीवर कैंसर से 7 प्रगति कर सकते हैं। इसलिए, इस विधि के समग्र लक्ष्य यकृत steatotic की स्थिति के पशु और सेल मॉडल उत्पन्न करने के लिए और पीआर करने के लिए हैकुशल और सटीक मापन के लिए लिपिड ovide विस्तृत प्रोटोकॉल। इन मॉडलों और माप भी ऐसे इंसुलिन प्रतिरोध और टाइप 2 मधुमेह के रूप में अन्य चयापचय संबंधी विकार, की जांच के लिए उपयोगी होते हैं।
मोटापा NAFLD, एक उच्च वसा के लिए महत्वपूर्ण जोखिम कारकों में से एक होने के लिए पहचाना जाता है के रूप में, उच्च सुक्रोज आहार (HFHS) है कि पश्चिमी शैली के उच्च वसा वाले आहार लुभाती चूहों में मोटापे के लिए प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। बाद में, यकृत स्टीटोसिस की डिग्री अलग अलग तरीकों का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है। सबसे पहले, शरीर के वजन और परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) के साथ शरीर की संरचना विश्लेषण समय खिला दौरान लिपिड संचय दिखा। वसा द्रव्यमान और दुबला मास एक गैर इनवेसिव और वास्तविक समय तरीके से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।
इसके अलावा, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) दोनों पूरे शरीर और वसा के जिगर वितरण दिखाने के लिए प्रयोग किया जाता है। एमआरआई विश्लेषण के स्केल संकेत एक सुपाठ्य छद्म रंग छवि में परिवर्तित किया जा सकता है, और की तीव्रतास्केल और रंग अर्ध-quantifiable है। इस प्रौद्योगिकी जीवित पशुओं में लिपिड संचय की माप के लिए अद्वितीय लाभ प्रदान करता है। दूसरा, जिगर के histological विश्लेषण यकृत स्टीटोसिस निर्धारित करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि है। जबकि तेल लाल हे धुंधला आकार और hepatocytes में लिपिड बूंदों की स्थिति से पता चलता Hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला हो जाना, इस तरह के hepatocyte आकृति विज्ञान और मैक्रोफेज घुसपैठ के रूप में ऊतकीय जानकारी प्रदान करता है। तीसरा, लिपिड सामग्री क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल निकासी का उपयोग कर विश्लेषण यकृत लिपिड का एक सटीक और मात्रात्मक माप है। कुल ट्राइग्लिसराइड और कोलेस्ट्रॉल के स्तर जैव रासायनिक तरीकों से मापा जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, लिपिड निकासी विश्लेषण और तेल लाल हे धुंधला भी आनुवंशिक छेड़छाड़ या pharmaceutically इलाज किया hepatocytes में इस्तेमाल किया जा सकता है।
वर्तमान पद्धति का लाभ यकृत steatotic मॉडल उत्पन्न करने के लिए कई अनुकूलित दृष्टिकोण के अपने उपयोग हैऔर व्यापक दोनों vivo में इन विट्रो में phenotypes को चिह्नित करने के लिए। डियो माउस मॉडल मानव फैटी लीवर रोग की विकृति और चयापचय phenotypes पुनरावृत्ति कर सकते हैं। मानव में अन्य चयापचय मानकों को अच्छी तरह से 8 के रूप में इस मॉडल में दोहराया जा सकता है। उच्च ग्लूकोज प्लस इंसुलिन के जवाब में steatotic hepatocyte मॉडल की पीढ़ी कुशल, उपयोगी है, और महंगी और समय लेने माउस काम की सीमा पर काबू। साथ में ले ली, इन तरीकों पर्याप्त पोषक तत्व और अधिक भार के दौरान यकृत रोग लिपिड और इंसुलिन प्रतिरोध के अध्ययन के लिए आवश्यक हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
NAFLD कि उपापचयी सिंड्रोम, मोटापा, इंसुलिन प्रतिरोध, या टाइप 2 मधुमेह (T2DM) 11 के साथ जुड़ा हुआ है प्रगतिशील जिगर रोगों की एक श्रृंखला है। NAFLD की बानगी स्टीटोसिस, hepatocytes में लिपिड का संग्रह है। इधर, तरीकों क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.
Materials
| O.C.T compound | SAKURA | 4583 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625-25G | |
| Infinity Triglycerides kit | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Infinity Cholesterol kit | Fisher Scientific | TR13421 | |
| Collagen type I, Rat tail | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (low glucose) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1mM for stock |
| Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| 10cm cell culture dish | Corning | 420167 | |
| 6-well-plate | Corning | 3516 | |
| BCA assay | Beyotime | P0010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance | Niumag technology | MiniQMR23-060H-I | |
| High fat high surcose diet(HFHS) | Research Diets | D12327 |
References
- Angulo, P. Medical progress – Nonalcoholic fatty liver disease. New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).
- Chen, X., et al. Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha. Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).
- Li, Y., et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).
- Li, Y., et al. Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21. Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).
- Esau, C., et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).
- Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).
- Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. Human fatty liver disease: old questions and new insights. Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).
- Hebbard, L., George, J. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).
- Chen, Y., et al. Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier. Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).
- Gong, Q., et al. Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice. Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).
- Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).
