Lesão por esmagamento aórtico murino: um eficiente<em> In Vivo</em> Modelo de proliferação de células musculares lisas e função endotelial
Summary
Restenosis após procedimentos cardiovasculares (cirurgia de bypass, angioplastia ou stent) é um problema significativo que reduz a durabilidade desses procedimentos. Uma terapia ideal inibiria a proliferação de células musculares lisas (VSMC) enquanto promovia a regeneração do endotélio. Descrevemos um modelo para avaliação simultânea da proliferação de VSMC e função endotelial in vivo.
Abstract
A reconstrução arterial, seja a cirurgia de angioplastia ou de derivação, envolve trauma iatrogênico causando ruptura endotelial e proliferação de células musculares lisas vasculares (VSMC). Modelos murinos comuns estudam pequenos vasos como as artérias carótida e femoral. Aqui, descrevemos um sistema in vivo no qual tanto a proliferação de VSMC quanto a função de barreira endotelial podem ser avaliadas simultaneamente em um vaso grande. Estudamos a resposta aórtica infra-renal a lesão em camundongos C57BL / 6. A aorta foi ferida da veia renal esquerda para a bifurcação aórtica por 30 esmagamentos transmurais de 5 segundos de duração com um aplicador com ponta de algodão. As alterações morfológicas foram avaliadas com histologia convencional. A espessura da parede da aorta foi medida a partir da superfície luminal para adventitia. A integração de EdU e a coloração de contadores com DAPI e alfa-actina foram utilizadas para demonstrar a proliferação de VSMC. A ativação de ERK1 / 2, um conhecido moderador da formação de hiperplasia intimal, foi dissuadidoExtraído pela análise Western Blot. O efeito da inflamação foi determinado por imuno-histoquímica para células B, células T e macrófagos . As seções de face do endotélio foram visualizadas com microscopia eletrônica de varredura (SEM). A função de barreira endotelial foi determinada com coloração Evans Blue. A lesão transmural resultou em espessamento da parede aórtica. Esta lesão induziu a proliferação de VSMC, mais proeminente aos 3 dias após a lesão e a ativação precoce de ERK1 / 2 e diminuiu a expressão de p7 kip1. A lesão não resultou em aumento da infiltração de células B, células T ou macrófagos na parede do vaso. A lesão causou desnudação de células endoteliais parciais e perda de contato célula-célula. A lesão resultou em perda significativa da função de barreira endotelial, que retornou à linha de base após sete dias. O modelo de ferimento aórtico transmural transmural murino fornece um sistema eficiente para estudar simultaneamente a proliferação de VSMC e a função de barreira endotelial em um vaso grande.
Introduction
Restenosis Após procedimentos cardiovasculares (cirurgia de bypass, angioplastia ou stent) é um problema significativo que reduz a durabilidade desses procedimentos. Todos os procedimentos de revascularização estão repletos de reestenose. As estratégias atuais para prevenir a reestenose (stents de libertação de fármaco e balões revestidos de drogas) inibem a célula muscular muscular lisa vascular (VSMC) e a proliferação de células endoteliais (EC). Conseqüentemente, essas intervenções impedem a reestenose mediada por VSMC, mas também impedem a regeneração do endotélio. Sem um endotélio intacto, os pacientes devem estar em potentes agentes antiplaquetários para diminuir o risco de trombose in situ no risco de complicações hemorrágicas. Uma terapia ideal inibiria a proliferação de VSMC enquanto promovia a regeneração do endotélio. Assim, há uma necessidade de estudar simultaneamente a proliferação de VSMC e a função de barreira endotelial i n vivo .
Atualmente, existemModelos de reestenose de mouse de al mouse 1 . Estes modelos incluem ligadura de carótida e lesão de fio arterial femoral 2 . Os modelos aórticos incluem posicionamento do stent 3 , lesão do balão 4 e aloenxerto aórtico 5 . Todos os modelos atuais são limitados. A ligação da carótida gera uma lesão neointimal mediada pelo fluxo e não possui lesão endotelial. Além disso, as artérias carotídeas e femorais têm muitas vezes menos camadas celulares que os vasos humanos, limitando seu valor de translação. A aorta do mouse, com aproximadamente 1,3 mm de diâmetro, é o único vaso que se aproxima de uma artéria humana (coronária) clinicamente relevante (3).
Apesar do potencial de tradução dos modelos aórticos murinos da doença, os modelos atuais têm limitações. Esses modelos exigem habilidades micro-cirúrgicas avançadas e equipamentos especializados, como balões de angioplastia e stents. Aqui, apresentamosUma técnica nova e reprodutível para induzir simultaneamente a proliferação de VSMC e interromper a função de barreira endotelial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Caracterizamos os efeitos de um modelo de lesão aórtica murina que resulta em hiperplasia mediana e disfunção da barreira endotelial. O destacamento parcial da CE ao longo da íntima da aorta acompanhou a perda do contato celular e o aumento das protrusões celulares. Correspondentemente, a função de barreira endotelial foi significativamente prejudicada, o que estimulou as vias de sinalização sensíveis aos mitógenos, levando à proliferação de VSMCs e engrossamento da parede vascular. Os pontos fortes deste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Hsia Ru-ching PhD, do Centro de Microscopia Eletrônica da Faculdade de Medicina da Universidade de Maryland, pelo seu suporte técnico no processamento das amostras de microscopia eletrônica de varredura.
Materials
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
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