Murin Aort Kırma Yaralanması: Verimli<emIn vivo</em> Düz Kas Hücresi çoğalması ve Endotel Fonksiyon Modeli
Summary
Kardiyovasküler prosedürleri takiben yapılan restenoz (baypas cerrahisi, anjiyoplasti veya stentleme) bu prosedürlerin dayanıklılığını azaltmakta önemli bir sorundur. İdeal bir terapi düz kas hücresi (VSMC) proliferasyonunu inhibe ederken endotelin rejenerasyonunu teşvik eder. VSMC çoğalması ve endotel fonksiyonunun in vivo olarak eşzamanlı olarak değerlendirilmesi için bir model tanımlıyoruz.
Abstract
Arteryel rekonstrüksiyon, ister anjiyoplasti ister baypas cerrahisi olsun, iyatrojenik travmayı endotel hasarına ve vasküler düz kas hücresi (VSMC) proliferasyonuna neden olur. Ortak fare modelleri karotis ve femoral arterler gibi küçük damarları inceler. Burada hem VSMC çoğalması hem de endotel bariyer fonksiyonunun aynı anda büyük bir kapta değerlendirilebildiği bir in vivo sistem tanımlanmaktadır. C57BL / 6 farelerde yaralanmaya karşı infrarenal aortik tepki üzerinde çalıştık. Aort, sol böbrek veninden aortik bifurkasyona 5 saniyelik sürtünme ile pamuk uçlu aplikatör ile yaralandı. Morfolojik değişiklikler konvansiyonel histoloji ile değerlendirildi. Aort duvar kalınlığı lüminal yüzeyden adventi- teye kadar ölçüldü. VSUc çoğalmasını göstermek için DUI ve alfa-aktin ile EdU entegrasyonu ve sayaç boyama kullanıldı. İntimal hiperplazi oluşumunun bilinen bir düzenleyicisi olan ERK1 / 2'nin aktivasyonu caydırıcıydıWestern Blot analizi ile çıkarıldı. Enflamasyonun etkisi, B hücreleri, T hücreleri ve makrofajlar için immünhistokimyasal yöntemle belirlendi . Endotelin yüz bölümleri taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile görselleştirildi. Evans Blue boyama ile endotel bariyer fonksiyonu belirlendi. Transmural yaralanma aort duvarı kalınlaşmasına neden oldu. Bu hasar, VSMC çoğalmasını, en belirgin şekilde yaralanmadan 3 gün sonra indükledi ve ERK1 / 2'nin erken aktivasyonu ve p27 kip1 ekspresyonunu azalttı. Yaralanma, damar duvarında artmış B-hücreleri, T-hücreleri veya makrofaj infiltrasyonuyla sonuçlanmadı. Yaralanma, kısmi endotel hücresi soyulmasına ve hücre-hücre temasının kaybına neden oldu. Yaralanma, endotel bariyer fonksiyonunda belirgin bir kayıp ile sonuçlandı ve bu, yedi gün sonra başlangıç noktasına döndü. Kemirgen transmüral künt aort yaralanması modeli, VSMC çoğalmasını ve endotel bariyer fonksiyonunu büyük bir kapta eşzamanlı olarak incelemek için etkili bir sistem sağlar.
Introduction
Restenoz (Bypass ameliyatı, anjiyoplasti veya stentleme) kardiyovasküler prosedürlerin ardından bu prosedürlerin dayanıklılığını azaltmakta önemli bir problemdir. Tüm revaskülarizasyon prosedürleri restenoz tarafından engellenmektedir. Restenozu (ilaç salınımlı stentler ve ilaç kaplı balonlar) önlemek için mevcut stratejiler hem vasküler düz kas hücresi (VSMC) hem de endotel hücre proliferasyonunu (EC) inhibe etmektedir. Sonuç olarak, bu müdahaleler VSMC aracılı restenozu engeller, aynı zamanda endotelin yenilenmesini önler. Sağlam bir endotel olmadan, hastaların, kanama komplikasyonları riski altında in situ tromboz riskini azaltmak için güçlü anti-platelet ajanlar üzerinde olması gerekmektedir. İdeal bir terapi, endotelin rejenerasyonunu teşvik ederken VSMC çoğalmasını inhibe eder. Bu nedenle, VSMC çoğalmasını ve endotel bariyer fonksiyonunu aynı anda çalışmak için bir vesikaya ihtiyaç vardır.
Halen, sever varRestenosis 1 al fare modelleri. Bu modeller karotis ligasyonu ve femoral arter tel hasarı 2'yi içerir . Aortik modeller arasında stent yerleştirme 3 , balon hasarı 4 ve aortik allograft 5 bulunur . Mevcut modellerin tümü sınırlıdır. Karotis ligasyonu, akış aracılı bir neointimal lezyon oluşturur ve endotel hasarına sahip değildir. Buna ek olarak, hem karotis hem de femoral arterler, insan damarlarına göre çok daha az kat kat daha az hücre katına sahiptir ve translasyonel değerlerini sınırlar. Çapı yaklaşık 1.3 mm olan fare aortu, klinik açıdan alakalı (koroner) bir insan artere yaklaşık tek damartır (3).
Kemirgen aortik modellerin translasyonel potansiyeline rağmen, mevcut modellerin kısıtlamaları vardır. Bu modeller gelişmiş mikrocerrahi becerileri ve anjiyoplasti balonları ve stentler gibi özel ekipman gerektirir. Burada,Eşzamanlı olarak VSMC proliferasyonunu uyarmak ve endotel bariyer fonksiyonunu bozmak için yeni, tekrarlanabilir bir teknik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medial hiperplazi ve endotel bariyer disfonksiyonu ile sonuçlanan bir murin aort yaralanma modelinin etkilerini karakterize ettik. Aort intima boyunca kısmi AT dekolmanı, hücre-hücre teması kaybına ve hücre çıkıntılarının arttırılmasına eşlik etti. Buna paralel olarak, endotel bariyer fonksiyonu önemli ölçüde bozulmuş ve mitojen duyarlı sinyal yollarını uyarmış ve VSMC'lerin çoğalmasına ve damar duvarının kalınlaşmasına yol açmıştır. Bu modelin güçlü yönleri, hastalığın…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maryland Üniversitesi Tıp Fakültesi Elektron Mikroskopi Çekirdek Tesisi'nden Hsia Ru-ching Doktora programına, tarama elektronik mikroskobu örneklerini işleme konusundaki teknik desteği için teşekkür ediyoruz.
Materials
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
- Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med. 6 (4), 389-395 (2000).
- Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
- Baker, A. B., et al. Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice. Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).
- Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia. J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).
- Li, J., et al. Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice. Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Turbett, G. R., Sellner, L. N. The use of optimal cutting temperature compound can inhibit amplification by polymerase chain reaction. Diagn Mol Pathol. 6 (5), 298-303 (1997).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S. On the mechanism of Verhoeff’s elastica stain: a convenient stain for myelin sheaths. Histochem. 62 (3), 233-247 (1979).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Nelson, P. R., Yamamura, S., Mureebe, L., Itoh, H., Kent, K. C. Smooth muscle cell migration and proliferation are mediated by distinct phases of activation of the intracellular messenger mitogen-activated protein kinase. J Vasc Surg. 27 (1), 117-125 (1998).
- Rzucidlo, E. M. Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation. Vascular. 17, S15-S20 (2009).
- Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).
- Yu, D., et al. MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism. PLoS One. 10 (11), e0141397 (2015).
- Banai, S., et al. Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation – kinetics, reproducibility, and implications. Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).
