Introduction
Korrekt identifiering av cardiomyocyte kärnor och cellcykeln status är av avgörande betydelse för fastställandet av hjärtmuskeln omsättning och förnyelse. Detta gäller särskilt för användningen av kärn markörer, såsom phh3, Ki-67, eller tymidinanaloger, för identifiering av cellcykelaktivitet. Som fortplantningsförmågan hos vuxna hjärtmuskelceller däggdjur är mycket liten en, en falsk identifiering av en kärna positivt för en spridning markör för en cardiomyocyte kärna kan göra en avgörande skillnad i resultatet av en proliferationsanalys. Dessutom kardiomyocyter är benägna att variationer i cellcykeln, såsom endoreduplikation och acytokinetic mitos, som resulterar i polyploida och multinukleära celler snarare än i celldelning. För detta ändamål, är tolkningen av antikroppar färgning mot vanliga cellcykel markörer inte avgörande i samtliga fall.
Här presenterar vi metoder för raka forwa rd erkännande av mus cardiomyocytes och deras nukleära i inhemska isolerade celler och tjocka vävnadssnitt vid postnatal och vuxna stadier av entydig identifiering av sina kärnor. För detta ändamål framställdes en transgen mus linje med cardiomyocyte specifik expression av ett fusionsprotein bestående av human histon H2B och mCherry under kontroll av den Myh6 promotorn (Myh6-H2B-MCH) används två. Korsning denna mus linje med en transgen spridning indikator mus linje, i vilken uttrycket av en EGFP-anillin fusionsprotein är under kontroll av den allestädes närvarande kyckling aktin promotor med en CMV-förstärkare (CAG-EGFP-anillin), gör det möjligt att bestämning av cellcykelstatus. Byggnadsställningen protein anillin uttrycks specifikt i cellcykel aktiva celler 3, och dess differentiella subcellulära lokalisering under cellcykeln möjliggör live-tracking cellcykelprogression med en hög upplösning på M-fasef "> 4. Därför är den dubbla transgena mössen kan användas för att skilja mellan prolifererande cardiomyocytes och de som genomgår cellcykelvariationer. Detta bevisar särskilt användbar vid screening med avseende spridningsframkallande ämnen in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden av detta protokoll som involverar djur var i enlighet med de etiska normer vid universitetet i Bonn och följt de riktlinjer från direktiv 2010/63 / EG Europaparlamentets om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål.
1. In vitro Visualisering av cellcykelaktivitet i Födsel Cardiomyocytes
- Postnatal cardiomyocyte dissociation
- Pre-experimentella preparat
- Förbereda odlingsmedia (IMDM, 1% penicillin / streptomycin, 1% icke-essentiella aminosyror, 0,1% β-merkaptoetanol); mediet 1: lägga FCS till 2%; Medium 2: lägga FCS till 20%.
- Coat en 96-brunnars odlingsskål (halv-tillväxtområde: 15 mm 2) med 0,1% gelatin i PBS-lösning.
- hjärta dissektion
- Förbered en petriskål med 15 ml PBS och lagra den på is. Sterilisera två pincett och en liten sax genom att sätta dem i en torr glaspärla autoklav. Offra neonatal transgena möss (CAG-EGFP-anillin / Myh6-H2B-MCH) genom halshuggning. Öppna bröstkorgen, dissekera hjärtat ut, såsom beskrivs i Ehler et al. 2013 (J Vis Exp .; (79):. 50.154 doi: 10,3791 / 50.154), och överför den till iskall PBS. Gå vidare till nästa musen.
- Om du använder icke-homozygota häckande par, identifiera de transgena hjärtan med ett fluorescerande mikroskop. Sätt hjärtan i PBS under ett fluorescerande mikroskop. Kontrollera om EGFP-anillin uttryck (Ex .: 488 nm, Em .: 509 nm) och H2B-MCH uttryck (Ex .: 587 nm, Em .: 610 nm) med lämpliga filteruppsättningar.
- cardiomyocyte isolering
- Dissociera de valda hjärtan med hjälp av neonatal hjärt dissociation kit. Inkubera enzymblandningen 1 vid 37 ° C under 5 min. För erhållande av en ml av den slutliga enzymblandningen, tillsätt 945 | il av enzymblandningen 1-55 mikroliter av enzymblandning 2.
- Överför upp till 4 hearts från P1 - P3 möss eller upp till 2 hearts från P4 - P6 möss till en 1,5-ml reaction rör innehållande 1 ml enzymblandning och skär hjärtat i små bitar med sax. Överför lösningen till 15 ml reaktionsrör.
- Inkubera vid 37 ° C under 15 min. För att maximera kontakten mellan vävnaden och enzymerna, satte 15-ml rör nästan horisontellt i inkubatorn. Blanda genom att pipettera 5 - 10 gånger upp och ner med en 5-ml pipett. Upprepa detta steg tre gånger.
- Lägga 7,5 ml medium 2 (20% FCS) för att stoppa enzymreaktionen. Filtrera cellsuspensionen genom en 70 ^ m cellfilter. Skölj cell sil med 3 ml medium 2.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 300 x g under 15 min och kasta bort supernatanten. Återsuspendera pelleten i 500 mikroliter medium 1; röda blodkroppar lyser krävs inte för ytterligare experiment. Pipettera 10 | il av cellsuspensionen i en cell räkningskammare och bestämma antalet celler.
- För en 96-brunnsplatta: utsäde 10.000 celler per brunn i 120 mikroliter av mediet 1 (2% FCS). Platscellerna in i en inkubator (37 ° C och 5% CO2) och fortsätt omedelbart till transfektion.
- Pre-experimentella preparat
- Transfektion av neonatala kardiomyocyter med siRNA eller miRNA
- Torka en bänk med RNas saneringslösning för att avlägsna de RNaser. Rengör följande material med RNas sanering lösning: 10 mikroliter, 100-mikroliter, och 200-mikroliter pipetter och en isbox. Tö siRNA stock alikvoter (100 | iM) på is.
- Förbered 2 pm arbetar lager av si / miRNAs minskad serummedium (98 mikroliter av minskad serummedium + 2 mikroliter av siRNA 100 iM lager). Arbets lager skall användas samma dag. Frysning rekommenderas inte.
- Tillsätt 4 mikroliter av 2 iM lager till 6 mikroliter av minskad serummedium till en 0,5 ml reaktionsrör (beloppet för en 96-brunn, slut si / miRNA koncentration i 140 mikroliter: ~ 57 nM). Välj en lämplig volym för antalet brunnar som ska transfekteras med en viss si / miRNA.
- Förbered en mästare blandning av transfektionsreagens. Använd 10 mikroliter (0,6 pl transfektionsreagens + 9,4 mikroliter av minskad serummedium) för varje brunn (96 brunnar totalt).
- Tillsätt si / miRNA blanda till transfektionsreagens mix. Inkubera under 5 min på is. Pipettera 20 | il i varje brunn. Inkubera cellerna i 48 timmar vid 37 ° C och 5% CO 2 och sedan ersätta mediet i varje brunn med 120 mikroliter medium 1. Efter 24 timmar eller mer, gå vidare till fixering och immunofluorescens färgning.
- Fixering och immunofluorescens färgning
- Avlägsna mediet och tvätta cellerna en gång med PBS. Täcka cellerna med 4% -ig formaldehydlösning under 20 minuter. Ta bort formaldehydlösningen och tvätta cellerna en gång med PBS, och sedan täcka dem med PBS för lagring eller gå vidare till immunfärgning.
- Inkubera med primär antikropp (koncentration enligt tillverkarens instruktioner) i 0,2% Triton-X och 5% donkey serum under minst 2 timmar.Om färgning för α-actinin (spädning 1: 400; monoklonal anti-α-actinin), bets över natten vid 4 ° C.
- Ta bort den primära antikroppen och tvätta 3 gånger med PBS. Späd sekundära antikroppen i Hoechst lösning 1: 400 och inkubera under 1 h vid RT skyddas från ljus. Avlägsna antikroppen, tvätta med PBS 3 gånger, och täcka cellerna med PBS för lagring vid 4 ° C.
- Konfokal videomikroskopi
- Använd ett konfokalmikroskop för bildtagning. Öppna bildprogram. Öppna "A1plus Settings" och markerar kryssrutorna för Ch1, Ch2 och Ch3. Ställ Ch1 till DAPI, Ch2 till EGFP, Ch3 till Cy3 och CH4 till Cy4 genom att klicka på rullgardinsmenyn.
- För varje kanal, klicka på HV och ställa in den till 80 med hjälp av skjutreglaget. Ställ in Offset till 0 med hjälp av skjutreglage, och klicka på "Home" för att ställa in hål till startläget. Ställ in skanningsstorlek till 1024 x 1024 genom att klicka på rullgardinsmenyn.
- Klicka optimera att öppna"XYZ Size Setup" fönstret. Kontrollera "Perfect Voxel" rutan under "Föreslagna steg (z)". Öka laserintensiteter tills bilden är varken underexponerad eller överexponerad.
OBS: Till exempel; Ch1 (DAPI): 16%, Ch2 (EGFP): 12%, Ch3 (Cy3): 100%, Ch4 (Cy5): 1%. Ställ in Offset för alla kanaler till 0.
- Ta bilder med en 20X mål (200 gångers förstoring). Skanna en stor bild som består av kakel bilder (t.ex. 3 x 3).
- I bildbehandlingsprogram, gå till "Hämta" och välj "Scan stor bild" i rullgardinsmenyn. Under "Area" och välj "nuvarande position är på övre vänstra hörnet" i rullgardinsmenyn och ange "Antal fält i X och Y" till 3 x 3. Klicka på "Scan".
- Använd ett konfokalmikroskop för bildtagning. Öppna bildprogram. Öppna "A1plus Settings" och markerar kryssrutorna för Ch1, Ch2 och Ch3. Ställ Ch1 till DAPI, Ch2 till EGFP, Ch3 till Cy3 och CH4 till Cy4 genom att klicka på rullgardinsmenyn.
- bildanalys
- Definiera antalet cardiomyocyte kärnor genom att räkna H2B-Ch signaler och antalet kardiomyocyter genom att räkna α-actinin signaler.
- <li> Klicka på "Measure" och välj "Manual Measurement" i rullgardinsmenyn. Välj "Counts" från nästa rullgardinsmenyn. Klicka på kärnor med H2B-MCH signaler och därmed märkning och räkna dem. Gör samma sak för α-actinin-positiva celler för att få antalet cardiomyocytes.
- Definiera antalet cardiomyocyte kärnor genom att räkna H2B-Ch signaler och antalet kardiomyocyter genom att räkna α-actinin signaler.
- Räkna S / G2 fas kardiomyocyter med kärn EGFP-anillin signaler (EGFP-anillin + / H2BmCh + kärnor). Klicka på "Measure" och välj "Manual Measurement" i rullgardinsmenyn. Välj "Counts" från nästa rullgardinsmenyn. Markera kärnorna med EGFP-anillin signaler och H2B-MCH signaler genom att klicka på dem.
- Räkna kardiomyocyter med mitos specifika EGFP-anillin signaler (t.ex., Figur 1F och G), såsom cytoplasmatisk signaler, kontraktila ringar och midbodies. Klicka på "Measure" och välj "Manual Measurement" i rullgardinsmenyn. Välj "Counts" från nästa pulldown meny. Mark Cardiomyocytes med mitos specifika EGFP-anillin signaler (t.ex. figur 1F och G), cytoplasmatisk signaler, kontraktila ringar och midbodies genom att klicka på dem.
2. Fastställande av Kärnbildning i Adult Cardiomyocytes av Langendorff dissociation och Tjocka vävnadssnitt
- Isolering av vuxna cardiomyocytes från Langendorff dissociation
- Förberedelser inför hjärta dissektion
- Fyll en insulinspruta (30-gauge-nål) med heparin (20 enheter / g kroppsvikt). Ta tag i musen genom nackskinnet. Lyft och vrid musen bakåt för att exponera buken för injektion.
- Utför en intraperitoneal injektion. Sätt heparin musen tillbaka i buren och vänta minst 15 minuter innan hjärtat dissektion. Skölj och ventilera Langendorff apparat med 5 - 10 ml av perfusion buffert (perfusion buffert: 135 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCb2, 2,5 mM HEPES, 5 mM glukos och 25 mM BDM i DDH 2 O, justera pH till 7,4 med NaOH).
- hjärta dissektion
- Förbered en 10 cm petriskål med kyld (4 ° C) PBS och placera den på is. Fylla och ventilera en 1-ml spruta ansluten till en kanyl (20 gauge) med PBS. Fixera kanylen med modellera på gränsen av petriskål. Placera kanylspetsen något under PBS yta.
- Offra musen genom halsdislokation. Torka av buken med 70% etanollösning. Gör ett snitt från mitten av buken till bröstbenet med kirurgisk sax. Ta bort membranet och skära bröstkorgen bilateralt med kirurgisk sax.
- Lyft och fäst bröstbenet med en 20-gauge nål, öppna brösthålan, och försiktigt ta tag i hjärtat med anatomiska pincett. Lyft hjärtat och ta bort den från lungorna och kärl genom att skära kärlen i utflöde.
OBS: För att identifiera aortan, placera hjärtat meddess ventrala sida upp. Detta minskar avståndet mellan de båda förmaken, så aorta med dess grenar kan hittas mellan förmaken. Beroende på den enskilda hjärt arkitektur, kan grenarna tas bort om den huvudsakliga grenen av aorta är fortfarande tillräckligt länge. - Överföra hjärtat till 10-cm petriskål med kyld PBS (se steg 2.1.2.1). Cannulate hjärtat genom att dra den uppåtgående aorta på en G20x1 ½ injektionskanyl, som gjordes trubbigt genom en oscillerande multiverktyg för att undvika vävnadsskada. Fixera aortan med en gänga på kanylen. Skölj försiktigt hjärtat med PBS för att avlägsna överskott av blod genom att trycka på sprutkolven. En liten förstoring av hjärtat ska vara synlig.
- Langendorff hjärt dissociation
- Anslut kanyl hjärtat snabbt luerförslutningstillsatsen på Langendorff perfusion apparaten. BEGJUTA hjärtat med 30 ml syresatt perfusions-buffert vid 37 ° C under 5 min med en flödeshastighet av 1 droppe / s. the flödeshastighet kan anpassas genom att reglera O 2 flödet i Langendorff apparat med hjälp av tryckreduceringsventil (tryck mellan 0 och 200 mbar).
- Förbered matsmältningen buffert omedelbart före användning: perfusion buffert med 6 U kollagenas B, 10.000 enheter trypsin, och 50 | iM CaCl2. Avlägsna perfusionsbuffert och starta enzymatisk digerering genom att tillsätta 30 ml varmt (37 ° C) och syresatt digereringsbuffert.
OBS: Mängden kollagenas B måste titreras beroende på aktiviteten hos olika partier. - Justera flödet till en hastighet av 1 droppe / s och smälta hjärta för 10-13 min. För att undvika kontaminering, inte använda utflödet igen. Överföra hjärtat till en 10-cm Petri-skål med 5 ml uppslutningsbuffert. Dissekera vävnaden manuellt med pincett genom att hålla hjärtat med en pincett och använda det andra paret att slita hjärtat i små bitar.
OBS: I detta steg, förmaken kan separeras, skuren i småbitar (med iris sax) och digererades under 30 min i 750 mikroliter av digereringsbuffert i inkubator vid 37 ° C för att erhålla isolerade atriella celler. För att få rena förmakshjärtmuskelceller, pipett upp och ner flera gånger med hjälp av en 1 ml pipett. Stoppa enzymreaktionen genom tillsats av 750 mikroliter av stopplösning. - Stoppa digerering genom att tillsätta 5 ml stopplösning (perfusion buffert med 5% FBS och 50 | iM CaCl2). Med användning av en serologisk pipett, filtrera cellsuspensionen genom en 100 | im cellfilter och samla upp cellerna i en 50-ml centrifugrör. Centrifugera den filtrerade cellsuspensionen vid 80 x g under 1 min vid rumstemperatur.
- Kasta bort supernatanten och försiktigt återsuspendera cellpelleten i 10 ml stopplösning med användning av en 10 ml serologisk pipett. Centrifugera cellsuspensionen vid 80 x g under 1 min vid rumstemperatur.
- Efter centrifugering, kasta supernatanten och suspendera cellerna i 1 ml odlingsmedium (IMDM med 20% FCS, 0,1 mM icke-essentiella aminosyror, 50 | ig / ml vardera av penicillin och streptomycin och 0,1 mM β-merkaptoetanol) för odling. Alternativt, gå vidare till steg 2,2, "immunofluorescensfärgning" och fixera cellerna.
- För fixering på 24-brunnars plattor, platta 10.000 av de isolerade celler per brunn på 8 | ig / ml laminin-belagda täckglas i 24-brunnars plattor med 500 mikroliter av odlingsmedium vid 37 ° C och 5% CO2 under åtminstone 3 h .
- Förberedelser inför hjärta dissektion
- Immunofluorescens färgning på Langendorff-isolerade kardiomyocyter i suspension
- Fix Langendorff-isolerade kardiomyocyter i 1 ml 4% PFA i PBS, pH 7,4, under 15 min vid rumstemperatur. Centrifugera cellsuspensionen vid 800 x g under 2 min vid rumstemperatur, ta bort fixativ, och tvätta cellerna två gånger med PBS.
- Resuspendera de fasta kardiomyocyter i 1 ml PBS och antingen fortsätta behandlingen av immunofluorescensfärgning eller lagra dem i 500 mikroliter av PBS per brunn påen 24-brunnars platta vid 4 ° C. Överföra en del av cellsuspensionen (~ 100-200 mikroliter) till ett mikrocentrifugrör. Centrifugera cellsuspensionen vid 800 x g under 2 min vid rumstemperatur och häll bort supernatanten.
- Permeabilisering, blocket, och fläcka cellerna med primär antikropp mot α-actinin genom att tillsätta 200 mikroliter av primär antikropp utspädd 1: 400 i PBS med 0,2% Triton X-100 och 5% donkey serum under 1 h vid rumstemperatur.
- Centrifugera vid 800 x g under 2 min vid rumstemperatur och häll bort supernatanten. Tvätta cellpelleten med PBS och centrifugera vid 800 xg under 2 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och inkubera i 200 mikroliter av Alexa-Fluor-konjugerad sekundär antikropp (anti-mus IgG1) utspädd 1: 400 i Hoechst färgämne (arbetslösning: 1 mikrogram / ml) under 1 h vid rumstemperatur, skyddad från ljus.
- Centrifugera vid 800 x g under 2 min vid rumstemperatur och häll bort supernatanten. Upprepa detta steg. Skydda provet från ljus. Resuspend cellerna i 200-500 | il av PBS och överföra 100-300 mikroliter av cellsuspensionen till en brunn i en mikroskopi kammaren. Stäng locket hos kammaren och lagra cellerna vid 4 ° C tills avbildning. Skyddas från ljus.
- Analys av den nukleära av Langendorff-isolerade kardiomyocyter
- Ta bilder från α-actinin-färgade kardiomyocyter med en 25X objektiv, vilket motsvarar en 250X förstoring. Räkna antalet H2B-MCH + kärnor endast i de kardiomyocyter som regelbundet färgade av α-actinin och visar typiska stavformad morfologi och därför antas vara intakt.
- Räkna minst 100 cardiomyocytes från tre olika hjärtan. Beräkna procentandelar av mononukleära, binukleär och tricykliska kardiomyocyter.
OBSERVERA: Normalt bör binukleära celler utgör cirka 80-90%, medan tricykliska celler och de med större antal kärnor är sällsynta (<1% i Langendorff-isolerade kardiomyocyter, <3% i tjocka skivor). Förmakshjärtmuskelceller är betydligt mindre än ventrikulära kardiomyocyter. Typiskt, mononukleära celler utgör 90% av den totala befolkningen.
- Isolering, fixering och frysförvaring av vuxna hjärtan som förberedelse för tjocka skivor
- Sätta ihop en perfusionsapparat för fixering genom att ansluta en 50-ml spruta till en 3-vägs kran med en Heidelberger förlängningsrör och en andra 3-vägsavstängningskran. Fixera sprutan i ett stativ på ett sådant sätt att genomströmnings aktiveras av tyngdkraften. Fylla systemet med 15 ml PBS.
- Följ steg 2.1.2.1-2.1.2.4, "hjärta förberedelse." Anslut G20x1 ½ injektionskanyl med hjärtat för att Luer-låset adaptern av bubbelfri-PBS-fyllda perfusionsapparat och BEGJUTA den med PBS. Fylla systemet med 10 - 15 mL av 4% formaldehyd i PBS, som sedan perfunderade genom hjärtat. Nedsänkning fixa hjärta i 4% formaldehydlösning under natten.
- Byt ut 4% formaldehydlösningen med PBS och tvätta hjärtat i PBS på en horisontell skakanordning vid 150 rpm under 8 h vid rumstemperatur. Byta ut PBS med 20% sukroslösning för att dehydratisera hjärtat över natten vid 4 ° C.
- Frysa hjärtat i Cryo-inbäddningsmedium i en liten gjutform.
- Inrätta en bägare fylld med 2-metylbutan och placera den i en låda med torr is. Sätta hjärtat i en frysning form tidigare halv-fylld med Cryo bädda medium och täcka den helt med Cryo bädda medium. Placera försiktigt formen i kylan bägaren, förhindrar kontakt av Cryo-inbäddning medium med 2-metylbutan. Lagra den frusna vävnaden vid -80 ° C fram till användning.
- Framställning av tjocka hjärt skivor
- Använd följande inställningar i en cryotome: ett objekttemperatur på -18 till -20 ° C, en kammartemperatur av -21 till -23 ° C, en clearing vinkel på knivhållaren av 4 °, och fjäder R35 Eggen blad.
- Ta frysförvarade organ från frysbehållaren och fixa det på preparatskivan med Cryo-inbäddning mediet med hjälp av snabbfrysning hyllan. Placera hjärtat på ett sådant sätt att sektione börjar vid spetsen.
- Klipp bort 50-im skivor tills en jämn skärplanet uppnås och orgeln blir synlig. Skär 50-iM vävnadssnitt med hjälp av cryotome i manuellt läge med en långsam hastighet och med snittsträckarplattan placerad på kniven. Mount skivor på saltlösningsbehandlade objektglas. Låt skivorna torka under 30 min vid rumstemperatur och lagra bilderna vid -80 ° C eller bets direkt.
- Färgning av tjocka hjärt skivor (kärnor och cellmembran)
- Behandla hjärt skivor med RNAs A (20 | ig / ml) i tvättbuffert (0,5 M NaCl, 0,1 M Tris, pH 7,5, och 50 mM EDTA) i en kyvett för en timme vid 37 ° C. Inkubera skivorna i 0,2% Triton-X i tvättbuffert under 30 min vid rumstemperatur. Tvätta skivorna två gånger under 5 minuter vardera i tvättbuffert i en kyvett på enhorisontell skakanordning vid rumstemperatur.
- Fläcken över natten med 1 ^ M TO-PRO3 jodid (642/661) och fluorescein-kopplade agglutinin från vetegroddar (WGA, 1: 100) i tvättbuffert vid 4 ° C. Tvätta skivorna tre gånger under 5 minuter vardera med tvättbuffert i kyvetter på en horisontell skakanordning och täcka dem med polyvinylalkohol monteringsmedium med en anti-fading reagenset och ett täckglas.
- bildinsamlande
- Helst använda en inverterad konfokala laserskanning mikroskop utrustat med en 40X / 1,15 NA vattendoppning mål. Sök efter öga för ett område inom segment som består av längsgående fodrade kardiomyocyter; för detta ändamål, är fluorescein-WGA kanal (Ex .: 488 nm) är bäst lämpad.
OBS: Detta steg är viktigt, eftersom de övre och nedre gränserna för cardiomyocytes ska synas inom z-stack för senare analyser. Eftersom bilddjupet är begränsad till ~ 30 nm och tjockleken av den del är 50 | im, är det inte möjligt att imålder tvärsnitt av dessa celler (cell längd: ~ 120 mikrometer). - Justera inställningarna i bildbehandlingsprogram. Öppna bildprogram. Öppna A1plus Inställningar och markerar kryssrutorna för Ch2, Ch3, och CH4. Ställ Ch2 att EGFP, Ch3 till Alx546 och CH4 till Alx647 genom att klicka på rullgardinsmenyn.
- För varje kanal, klicka på HV och ställa in den till 80 med hjälp av skjutreglaget. Ställ in Offset till 0 med hjälp av skjutreglage. Klicka på "Home" -knappen för att ställa in hål till utgångsläget. Ställ in skanningsstorlek till 1024 x 1024 genom att klicka på rullgardinsmenyn och klicka optimera för att öppna "XYZ Size Setup" fönstret. Kontrollera "Perfect Voxel" rutan under "Föreslagna steg (z)".
- Klicka på "live scan" och justera laserintensitet genom att klicka på skjutreglagen på de enskilda kanalerna. Kontrollera "Z-serien" rutan på "ND Acquisition" och klicka på "definieras av översta knappen" box. Definiera den övre ochknappen z-stack genom att klicka på lämpliga knappar efter justering av fokus på mikroskopet. Ställer in bredden z-steget till 0,5 | im.
OBS: Djupet på z-stack begränsas av det optiska penetrering inuti vävnaden och signal-till-brus-förhållande. - Gå till "A1plus Settings" och ange linjegenomsnitt / Integral till 2-4 genom att klicka på rullgardinsmenyn. Finjustera laserintensitet; pinhole bör vara så liten som möjligt för att bild i ett fokalplan.
- Helst använda en inverterad konfokala laserskanning mikroskop utrustat med en 40X / 1,15 NA vattendoppning mål. Sök efter öga för ett område inom segment som består av längsgående fodrade kardiomyocyter; för detta ändamål, är fluorescein-WGA kanal (Ex .: 488 nm) är bäst lämpad.
- Analys av kärnbildning
- Öppna bildanalysmjukvara och ladda z-stack av intresse.
- bestämma manuellt kärn i Z-stackar genom att bläddra igenom de olika skikten i stapeln för att identifiera celler som ligger helt inom stapeln; detta är fallet när WGA-färgning är synlig i alla dimensioner. Räkna antalet kärnor (de flesta av dem kommer att vara binukleär) och markera den analyserade cellen genom en anteckning i programmet. <li> Bestäm antalet CM kärnor (H2B-MCH +) och den totala kärnor (TO-PRO3 +) i 3D-rekonstruktioner för de enskilda kanalerna (Figur 2D). I bildbehandlingsprogram, klicka på "Binary" och välj "Definiera Threshold 3D" i rullgardinsmenyn. Välja från kanalen rullgardinsmenyn antingen Alx546 för antalet CM kärnor eller Alx647 för det totala antalet kärnor. Genom att klicka på lämpliga pilar, ställa in programmet till "Smooth 4x" Clean 1x, och Fyll hål på. Kontrollera "Size" rutan och ställ in den till 5 pm med hjälp av skjutreglaget. Ställ in tröskelvärdet genom att använda skjutreglaget tills separata objekt visas.
OBS: Efter applicering av fragmentering, visar resultatfönstret en tabell över kvantifierade händelser och en färgad fragmentering av bilden. Eftersom vissa kärnor direkt kontakt med varandra, korrigera automatisk mätresultatet för dubbletter, som kanske inte korrekt åtskilda av programvaran manuellt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att analysera effekterna av siRNA / miRNA på cellcykelaktivitet av postnatal cardiomyocytes in vitro, cardiomyocytes av dubbeltransgena Myh6-H2B-MCH / CAG-EGFP-anillin möss isolerade på postnatal dag 3 (P3) och transfekterades med cellcykelaktivitet framkallande miR199 5, siRNA P27, och siRNA Fzr1. Jämfört med den negativa kontrollen (Figur 1A), bilderna av miR199- (Figur 1B) och siRNA p27- (Figur 1C) transfekterade kardiomyocyter visar en induktion av cellcykelaktivitet. I EGFP-anillin musmodell kan siRNA mot Fzr1 användas som transfektions kontroller, eftersom inhiberingen av Fzr1 leder till ackumulering av EGFP-anillin-fusionsprotein i kärnorna hos transfekterade celler och en förlust av Fzr1 leder till hämningen av APC Fzr1. Fzr1 är en kofaktor av anafas befrämjande komplex E3-ligas, som riktar anillin för proteasOMAL nedbrytning. Figur 1D visar ett konfokalt översiktsbild av siRNA Fzr1-transfekterade kardiomyocyter 3 dagar efter transfektion, vilket indikerar en transfektionseffektivitet på ~ 45%. Kardiomyocyter som utför endoreduplikation (t.ex. efter knockdown av p27 6) visar endast kärn EGFP-anillin uttryck (Figur 1E) eller EGFP-anillin negativ (se diskussion). De uttrycker inte EGFP-anillin i M-fas-typiska lokaliseringar (Figur 1F och G), som endoreduplikation består endast av en endo-S-fasen (EGFP-anillin-positiv) och en endo-G-fas (EGFP-anillin negativa ). I endo-G-fas, är APC aktiv, vilket resulterar i ubikitinering och nedbrytning av EGFP-anillin i proteasomen.
Kvantifiering av mono- och binucleated cardiomyocyte portioner vid sitt vuxna stadium kan utföras antingen vid encelliga nivå efter Langendorff dissociation av Myh6-H2B-MCH transgena hjärtan eller i tjocka cryoslices av transgena hjärtan. Efter den enzymatiska digestion av hjärtvävnaden på Langendorff apparat, förmak och kammare kan separeras mekaniskt och analyseras oberoende av varandra. Figur 2A visar en representativ bild av icke fasta H2B-MCH transgen ventrikulära kardiomyocyter efter Langendorff isolering med en hög grad av binucleated kardiomyocyter, såsom indikeras av den nukleära H2B-MCH-expression. Däremot är de flesta av förmakshjärtmuskelceller mononukleära (Figur 2B). Som den enzymatiska nedbrytning inte resulterar i 100% enstaka celler, mönstret av tvär strimmor avslöjades genom α-actinin färgning underlättar diskriminering mellan binucleated hjärtmuskelceller (kontinuerligt mönster av kors strimmor, figur 2C) och cell dubletter. Figur 2D visar ett exempel på identifieringen av en binucleated cardiomyocyte in påhick skiva.
3D-rekonstruktioner av tjocka skivor av vuxna Myh6-H2B-MCH transgena hjärtan kan användas för att bestämma andelen cardiomyocyte kärnor under fysiologiska betingelser i vävnaden. Använda 3D-modulen i bildprogram, Hoechst-färgade kärnor och H2B-MCH-positiva kärnor kan detekteras och räknas automatiskt, såsom visas i figur 2E. Slutresultatet bör korrigeras manuellt för dubbletter, vilket innebär kärnor som direkt berör varandra, i det här fallet. För att analysera kärnbildningsindex av kardiomyocyter i tjocka skivor, är det nödvändigt att manuellt rulla genom stapeln, eftersom kärnorna inte nödvändigt ligger inom ett z-planet. WGA färgning möjliggör detektion av cellgränserna.
Figur 1: Exempel på InVitro Visualisering av cellcykelaktivitet i Postnatal Cardiomyocytes efter transfektion med siRNA. (AD) P3 kardiomyocyter från EGFP-anillin / Myh6-H2B-MCH hjärtan färgade för α-actinin (vit). Cardiomyocyte kärnor identifieras av H2B-MCH signal (röd), cellcykelaktivitet genom EGFP-anillin signaler (grön) och kärnor av Hoechst nukleär färg (blå). (A) P3 kardiomyocyter transfekterade med scramble siRNA tjäna som den negativa kontrollen. Baren är 100 pm. (B) P3 kardiomyocyter transfekterade med miRNA-199 display betydligt fler EGFP-anillin signaler än kontrollen (A). Baren är 100 pm. (C) Exempel på enbart kärn EGFP-anillin signaler efter transfektion med p27 siRNA, vilket indikerar endoreduplikation. Baren är 80 pm. (D) Transfektion med siRNA mot Fzr1 för bestämning av transfektionseffektiviteten. Som EGFP-anillin accumulates, antalet EGFP-anillin + kardiomyocyter indikerar transfektionseffektivitet. Baren är 80 pm. (EG) Olika lokaliseringar av EGFP-anillin (grön) i kardiomyocyter under cellcykeln: nukleär lokalisering (pil i E), sammandragande ring (pilar i F), och midskepps lokalisering (pilen i G). Baren är 20 ^ m i (E) och 10 | j, m i (F och G). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Exempel på bedömning av Multinucleation av Langendorff Isolering av Cardiomyocytes från H2B-MCH möss och av 3D analys av tjocka skivor. (A, B) Ventrikulär (A) och förmaks (B) kardiomyocyter från hjärtan från vuxna H2B-MCH transgena möss efter isolering genom Langendorff dissociation. Staplarna är 50 pm. (C) Cardiomyocytes från Myh6-H2B-MCH hjärtan som färgats för α-actinin (grön). Cardiomyocyte kärnor identifieras av H2B-MCH signal (röd). Baren är 10 mikrometer. (D) Binucleated cardiomyocyte i en tjock skiva (pilar). Cardiomyocyte kärnor identifieras av H2B-MCH signal (röd), cellramar av WGA färgning (grön), och kärnor av ToPro3 (vit). Baren är 50 pm. (E) Workflow för 3D analys av binucleation i tjocka skivor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns en kontrovers över om cardiomyocytes kan återinträda i cellcykeln och dela efter skada och under vävnadshomeostas. Värden för grund omsättning av hjärtmuskelceller har givits i intervallet mellan 1% 1 och 80% 7. Även efter en hjärt skada har induktion av cellcykeln aktivitet och skapande av nya hjärtmuskelceller rapporterats i gränszonen, med värden mellan 0,0083% 8 och 25 till 40% 7. Dessa skillnader kan delvis förklaras av olika experimentella metoder för att identifiera hjärt kärnor, en process som är mycket utmanande på histologiska sektioner 9 och under celldelningen. Som kardiomyocyter är benägna att variationer i cellcykeln, är det av avgörande betydelse att skilja äkta celldelning från endoreduplikation och acytokinetic mitos, som leder till polyploida och flerkärniga celler. Föridentifieringen av celldelning, är det nödvändigt att visualisera kännetecken celldelning, såsom kontraktila ringar och midbodies, liksom för att bestämma den procentuella andelen av binucleated kardiomyocyter. Vi har utvecklat metoder för att analysera cellcykelaktivitet i kardiomyocyter i detalj och för att bestämma graden av nukleära i isolerade celler eller i tjocka sektioner.
Det är viktigt att notera att EGFP-anillin systemet ger direkt bevis på celldelning, genom visualisering av en symmetrisk sammandragande ring (figur 1F) och midskepps (figur 1G), och indirekta bevis för endoreduplikation och acytokinetic mitos. Såsom tidigare beskrivits, är förekomsten av en ensidig ingression av den kontraktila ringen en indikator på binucleation 10, och detta kan observeras med EGFP-anillin systemet.
Endoreduplikation föreslås så länge ingen kontraktila ring eller midbody observeras, vilket gör beräkningar av sannolikheten för att upptäcka dessa lokaliseringar obligatorisk. Om man antar en cellcykeltiden på 25 timmar, en genomsnittlig duration på sammandragande ring synlighet 20 minuter, och en midskepps ihållande 1 timme, bör det finnas en sammandragande ring i 100 dela EGFP-anillin-positiva celler och 4 midbodies. Statistiskt sett skulle minst 25 EGFP-anillin-positiva celler måste analyseras för att skilja celldelning av variationer i cellcykeln. Detta nummer ändras i enlighet därmed cellcykeln varaktighet (som ofta är okänd) ökar eller minskar. Detta innebär också att majoriteten av EGFP-anillin signaler kommer att vara kärn (figur 1E), som M-fas, den enda fas med icke-nukleära lokaliseringar, varar endast cirka en timme.
Under postnatal utveckling, tar binucleation plats i mus hjärtan och ökar till 90% i ventrikulära kardiomyocyter (~ 25% hos människa) 11. for analys av förnyelse i hjärtat, är det viktigt att bestämma graden av binucleation. Vi beskriver två metoder för att ta itu med denna viktiga morfologiska drag: nämligen Langendorff dissociation och skapandet av tjocka sektioner av hjärtvävnad. Medan Langendorff isolering är enklare och snabbare, är mer tidskrävande men också mer exakt morfologi tjocka sektioner. Intressant nog har vi funnit att Langendorff isolering överskattar andelen binukleära cardiomyocytes. Detta kan bero på olika överlevnad av mononukleära och binukleära celler under denna ganska styv förfarande.
Som induktion av proliferation i postnatal kardiomyocyter är en ny metod i hjärt förnyelse, beskriver detta protokoll ett screeningsystem genom att kombinera två transgen mus linjer, Myh6-H2BmCh och CAG-EGFP-anillin. Kardiomyocyter isolerade från hjärtan på postnatal dagar P1 - P6 kan lätt odlas och transfekterade med miRNA ellersiRNA eller behandlas med bibliotek av små molekyler. Cardiomyocyte kärnor kan manuellt eller automatiskt av mjukvarualgoritmer, och potentiella "träffar" kan bestämmas genom en ökning av MCH + kärnor nummer. Diskriminering av celldelning från endoreduplikation och acytokinetic mitos kan göras genom kvantifiering av de olika lokaliseringar av EGFP-anillin signaler. Detta system bör sprida lite nytt ljus på regleringsmekanismer underliggande postnatal cardiomyocyte spridning och kan leda till upptäckten av nya läkemedel för behandling av hjärtsjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri dish | Sarstedt | 821472 | |
| 100 µm cell strainer | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 352360 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| G20x1 ½ injection cannula, Sterican | Braun, Melsungen | 4657519 | |
| 20 gauge needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | |
| 24-well plates | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 353047 | |
| 2-Methyl-butane | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3927.1 | |
| 37% formaldehyde solution | AppliChem GmbH | A0936,1000 | |
| 3-way stopcock | B. Braun Medical Inc. | 16494C | |
| 50 mL syringe | B. Braun Medical Inc. | 8728810F | |
| 70% ethanol | Otto Fischar GmbH | 27669 | |
| Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-605-205 | |
| Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG | Sigma-Aldrich, Steinheim | A7811 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area | Greiner bio-one | 675986 | |
| Collagenase B | Roche | 11088815001 | |
| confocal microscope Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| cryostat CM 3050S | Leica | ||
| donkey serum | Jackson Immuno Research, Suffolk, GB | 017-000-121 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| fetal calf serum | PromoCell, Heidelberg | ||
| Formaldehyde solution (4%) | PanReac AppliChem | A3697 | |
| Gelatine from porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich, Steinheim | G2500 | |
| glass coverslips | VWR | 631-0146 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Heidelberger extension tube | IMPROMEDIFORM GmbH | MF 1833 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 5394.02.00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HistoBond microscope slides | Marienfeld | 0810000 | |
| Hoechst 33342 (1 mg/mL) | Sigma Aldrich, Taufkirchen | B2261 | |
| Insulin syringe | Becton Dickinson GmbH | 300334 | |
| Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 21980-032 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | Corning | 354221 | |
| Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti | Nikoninstruments, Düsseldorf | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | 13778075 | |
| Mouse IgG Cy5 (donkey) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| microcentrifuge tube | Sarstedt | 72690 | |
| Mini shaker | VWR | 12620-940 | |
| mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4464066 | |
| Biopsy Mold | Sakura Finetek/ VWR | 4565 | |
| M-slide 8-well ibiTreat | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Merck Millipore | 567530 | |
| negative control(scrambled RNA) | Ambion/Thermo Fischer Scientific | AM4611 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach | 130-098-373 | |
| NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit | Nikoninstruments, Düsseldorf | ||
| Non essential amino acids, NEAA | Gibco/Life Technologies, Darmstad | 11140-035 | |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco | 51985-026 | |
| P21-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| P27-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Steinheim | 14190-094 | |
| Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading | Sigma-Aldrich | 10981 | |
| RNase A | Qiagen | 1007885 | |
| RNaseZap | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | AM9780 | |
| sample containers | Vitlab | 80731 | |
| Serological pipette | Greiner | 607180 | |
| software NIS Elements | Nikon | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek/ VWR | 25608-930 | |
| ToPro3 iodide (642/661) | Molecular probes/ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X | Fluka | 93418 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93418 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeled | Vector Laboratories | VEC-FL-1021-5 | |
| α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Steinheim | M3148 |
References
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33 (2015).
- Field, C. M., Alberts, B. M. Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex. J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).
- Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076 (2012).
- Eulalio, A., et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration. Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).
- Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).
- Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation. J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).
- Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).
