Introduction
A correta identificação dos núcleos dos cardiomiócitos e o estado do ciclo celular é de importância crucial para a determinação do volume de negócios do músculo cardíaco e regeneração. Isto é especialmente verdadeiro para a utilização de marcadores nucleares, tal como pHH3, Ki-67, ou análogos de timidina, para identificar actividade do ciclo celular. Como a capacidade proliferativa dos cardiomiócitos de mamíferos adultos é muito pequeno 1, uma falsa identificação de um núcleo positivo para um marcador de proliferação de um núcleo de cardiomiócitos pode fazer uma diferença fundamental no resultado de um ensaio de proliferação. Além disso, os cardiomiócitos são propensos a variações no ciclo celular, tais como a endo-reduplicação e mitose acytokinetic, o que resulta em células poliplóides e multinucleadas em vez de na divisão celular. Para este fim, a interpretação de coloração de anticorpos contra marcadores do ciclo celular comuns não são conclusivas em todos os casos.
Aqui, apresentamos métodos para o straight-forwa Rd reconhecimento de cardiomiócitos de rato e a sua nuclearidade em células isoladas nativas e secções de tecido de espessura em fases pós-natal e adulto por a identificação inequívoca dos seus núcleos. Para esse efeito, uma linha de ratinhos transgénicos com expressão específica de cardiomiócitos de uma proteína de fusão que consiste de histona H2B humana e mCherry sob o controlo do promotor Myh6 (Myh6-H2B-MCH) foi usada 2. Cruzamentos esta linha de rato com uma linha de ratinhos indicador de proliferação transgénico, em que a expressão de uma proteína de fusão EGFP-anillin está sob o controlo do promotor de frango actina ubíqua com um intensificador de CMV (CAG-eGFP-anillin), permite a determinação do estado do ciclo celular. A proteína anillin andaime é especificamente expresso em células do ciclo celular activas 3, e a sua localização subcelular diferencial durante o ciclo celular permite a progressão do ciclo celular, o rastreio ao vivo com uma alta resolução de fase MEF "> 4. Por conseguinte, os ratinhos transgénicos dupla pode ser utilizado para discriminar entre proliferantes cardiomiócitos e aqueles que sofrem variações do ciclo celular. Isto prova especialmente úteis no rastreio de substâncias indutoras de proliferação in vitro.
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Protocol
Todos os procedimentos deste protocolo envolvendo animais estavam de acordo com os padrões éticos da Universidade de Bonn e respeitadas as diretrizes da Directiva 2010/63 / UE do Parlamento Europeu sobre a protecção dos animais utilizados para fins científicos.
1. In Vitro Visualização da actividade do ciclo celular em pós-natal Cardiomyocytes
- dissociação cardiomiócitos pós-natal
- preparações pré-experimental
- Preparar meios de cultura (IMDM, 1% de Penicilina / Estreptomicina, aminoácidos não essenciais a 1%, 0,1% β-mercaptoetanol); Meio 1: adicionar FCS a 2%; meio a 2: adicionar FCS a 20%.
- Revestimento de 96 cavidades de prato de cultura (meio de crescimento área: 15 mm 2), com 0,1% de gelatina na solução de PBS.
- dissecção coração
- Prepara-se uma placa de Petri com 15 mL de PBS e armazená-lo em gelo. Esterilizar duas pinças e tesouras pequenas, colocando-os em um esterilizador talão de vidro seco. Sacrifício camundongos transgênicos neonatal (CAG-eGFP-anillin / Myh6-H2B-HCM) por decapitação. Abertura do tórax, dissecar o coração, tal como descrito no Ehler et ai. De 2013 (J Vis Exp .; (79):. 50154 doi: 10.3791 / 50154), e transferi-lo para o PBS gelado. Mover para a próxima mouse.
- Se estiver usando casais não-homozigotos, identificar os corações transgénicos com um microscópio fluorescente. Colocar os corações em PBS sob um microscópio fluorescente. Verifique para a expressão eGFP-anillin (Ex .: 488 nm; Em .: 509 nm) e expressão H2B-MCH (Ex .: 587 nm; Em .: 610 nm) com os filtros adequados.
- isolamento dos cardiomiócitos
- Dissociar os corações selecionados usando o kit coração dissociação neonatal. Incubar a mistura de enzima 1 a 37 ° C durante 5 min. Para obter 1 ml de mistura de enzima final, adicionar 945 uL de mistura de enzima 1 a 55 ul de mistura de enzimas 2.
- Transferir até 4 corações de P1 - P3 ratos ou até 2 corações de P4 - ratos P6 a um 1,5-mL reaction tubo contendo 1 ml de mistura de enzima e cortar o coração em pequenos pedaços com uma tesoura. Transferir a solução para 15 tubos de reacção mL.
- Incubar a 37 ° C durante 15 min. Para maximizar o contato entre o tecido e as enzimas, colocar o tubo de 15 mL quase horizontalmente na incubadora. Misture pipetando 5 - 10 vezes para cima e para baixo com uma pipeta de 5 mL. Repita este passo três vezes.
- Adicionar 7,5 ml de meio de 2 (FCS a 20%) para parar a reacção enzimática. Filtra-se a suspensão de células através de um coador de células de 70 mícrons. Lavar o filtro de células com 3 ml de meio 2.
- Centrifugar a suspensão de células a 300 x g durante 15 min e desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 500 ul de meio 1; a lise das células vermelhas do sangue não é necessário para outras experiências. Pipetar 10 ul da suspensão de células para uma câmara de contagem de células e determinar o número de células.
- Para uma placa de 96 poços: semente 10.000 células por poço em 120 ul de meio 1 (2% de FCS). Lugar, colocaras células numa incubadora (37 ° C e 5% de CO 2) e prosseguir imediatamente para a transfecção.
- preparações pré-experimental
- Transfecção de cardiomiócitos neonatais com siRNAs ou miRNAs
- Limpe um banco com solução de descontaminação RNase para remover as RNases. Limpe o seguinte material com solução de descontaminação RNase: uma caixa de gelo de 10 ml, 100 ml, e 200-ul pipetas e. alíquotas Thaw siRNA de ações (100 mm) em gelo.
- Prepare 2 m stocks de trabalho de Si / miRNAs em meio de soro reduzido (98 mL de meio de soro reduzido + 2 mL de siRNA 100 M ações). O estoque de trabalho deve ser usados no mesmo dia. Congelamento não é recomendado.
- Adicionar 4 mL do stock de 2 ^ M e 6 mL de meio de soro reduzido a um tubo de reacção de 0,5 ml (para um valor de 96 poços-; concentração final de Si / miARN em 140 uL: ~ 57 nM). Escolha um volume apropriado para o número de poços a serem transfectadas com um certo Si / miARN.
- Preparar um master mix do reagente de transfecção. Utilizar 10 mL (0,6 mL de reagente de transfecção + 9,4 mL de meio de soro reduzido) para cada poço (96 cavidades no total).
- Adicionar a si / miRNA misture à mistura reagente de transfecção. Incubar durante 5 min em gelo. Pipetar 20 ul a cada poço. Incubam-se as células durante 48 h a 37 ° C e CO2 a 5% e, em seguida substituir o meio em cada poço com 120 uL de meio de 1. Depois de 24 h ou mais, proceder à fixação e coloração por imunofluorescência.
- Fixação e imunofluorescência coloração
- Remover o meio e lava-se as células uma vez com PBS. Cobrir as células com solução de formaldeído a 4% durante 20 min. Retire a solução de formaldeído e lave as células uma vez com PBS, e em seguida, cobri-los com PBS para armazenamento ou prosseguir para a imunocoloração.
- Incubar com anticorpo primário (concentração de acordo com as instruções do fabricante) em 0,2% de Triton-X e soro de burro a 5%, durante pelo menos 2 h.Se a coloração para α-actinina (diluição 1: 400; anticorpo monoclonal anti-α-actinina), mancha durante a noite a 4 ° C.
- Remover o anticorpo primário e lava-se 3 vezes com PBS. Dilui-se a solução de anticorpo secundário em Hoechst 1: 400 e incubar durante 1 h à temperatura ambiente ao abrigo da luz. Remover o anticorpo, lava-se com PBS 3 vezes, e cobrir as células com PBS, para armazenamento a 4 ° C.
- A microscopia confocal de vídeo
- Usar um microscópio confocal para a aquisição de imagem. Abra o software de imagem. Abra "Configurações A1plus" e marque as caixas para CH1, CH2, e CH3. Definir CH1 a DAPI, CH2 para eGFP, Ch3 para Cy3 e CH4 em Cy4 clicando no menu suspenso.
- Para cada canal, clique no HV e configurá-lo para 80, utilizando a barra deslizante. Defina o offset para 0 usando as barras deslizantes, e clique no botão "Home" para definir o pinhole para a posição inicial. Defina o tamanho de digitalização de 1.024 x 1.024, clicando no menu suspenso.
- Clique optimize para abrirjanela "XYZ Tamanho Setup". Marque a caixa "Perfect Voxel" em "Passo Sugerido (z)". Aumentar a intensidade do laser até que a imagem não é nem subexposta nem superexposta.
NOTA: Por exemplo; CH1 (DAPI): 16%, CH 2 (eGFP): 12%, CH 3 (Cy3): 100%, CH4 (Cy5): 1%. Definir o deslocamento para todos os canais a 0.
- Tirar fotografias utilizando uma objectiva 20X (200X). Digitalizar uma imagem grande que consiste das imagens de cerâmica (por exemplo, 3 x 3).
- No software de imagem, vá para "adquirir" e escolha "Digitalizar imagem grande" no menu suspenso. Em "Área", escolha "posição atual está no canto superior esquerdo" no menu suspenso e defina "Número de campos em X e Y" para 3 x 3. Clique em "Scan".
- Usar um microscópio confocal para a aquisição de imagem. Abra o software de imagem. Abra "Configurações A1plus" e marque as caixas para CH1, CH2, e CH3. Definir CH1 a DAPI, CH2 para eGFP, Ch3 para Cy3 e CH4 em Cy4 clicando no menu suspenso.
- análise de imagem
- Definir o número de núcleos dos cardiomiócitos pela contagem sinais H2B-Ch e do número de cardiomiócitos pela contagem sinais α-actinina.
- <li> Clique em "Measure" e escolha "Medição Manual" no menu suspenso. Escolha "conta" do próximo menu suspenso. Clique em núcleos com sinais H2B-MCH, marcando, assim, e contá-las. Faça o mesmo para células-α-actinina positiva para obter o número de cardiomiócitos.
- Definir o número de núcleos dos cardiomiócitos pela contagem sinais H2B-Ch e do número de cardiomiócitos pela contagem sinais α-actinina.
- Contagem cardiomiócitos fase G2 S / com sinais eGFP-anillin nucleares (eGFP-anillin + / H2BmCh + núcleos). Clique em "Measure" e escolha "Medição Manual" no menu suspenso. Escolha "conta" do próximo menu suspenso. Marque os núcleos com sinais eGFP-anillin e sinais H2B-MCH, clicando sobre eles.
- Contagem dos cardiomiócitos com sinais específicos de mitose eGFP-anillin (por exemplo, Figura 1F e L), tais como sinais citoplasmáticos, anéis contrácteis, e midbodies. Clique em "Measure" e escolha "Medição Manual" no menu suspenso. Escolha "conta" a partir da próxima pulMenu ldown. Mark cardiomiócitos, com sinais específicos de mitose eGFP-anillin (por exemplo, a Figura 1F e G), sinais citoplasmáticos, anéis contráteis e midbodies, clicando sobre eles.
2. Determinação da nucleação em adultos Cardiomyocytes por Langendorff dissociação e grossas cortes de tecidos
- Isolamento de cardiomiócitos adultos por dissociação de Langendorff
- Preparações dissecadas coração
- Encher uma seringa de insulina (agulha de calibre 30) com heparina (20 unidades / g de peso corporal). Segure o mouse pela nuca do pescoço. Levantar e virar o mouse para trás para expor o abdómen para injecção.
- Realizar uma injeção intraperitoneal. Coloque o rato heparinizado de volta para a jaula e esperar pelo menos 15 minutos antes de iniciar a dissecção coração. Lavar e ventilar o aparelho de Langendorff com 5 - 10 ml de tampão de perfusão (tampão de perfusão: NaCl 135 mM, KCl a 4 mM, 1 mM de MgCl2, 2,5 mM de HEPES, 5 mM de glucose, e BDM 25 mM em ddH2O, ajustar até pH 7,4 com NaOH).
- dissecção coração
- Prepare a 10 cm placa de Petri com refrigerado (4 ° C) PBS e colocá-lo em gelo. Encher e ventilar uma seringa de 1 mL ligada a um (calibre 20) de uma cânula com PBS. Fixar a cânula com massa de modelar, na fronteira da placa de Petri. Colocar a ponta da cânula ligeiramente abaixo da superfície do PBS.
- Sacrificar o mouse por deslocamento cervical. Limpe o abdômen com solução de etanol a 70%. Faça uma incisão a partir de meados do abdômen para o esterno com uma tesoura cirúrgica. Retirar o diafragma e cortar o tórax bilateralmente com uma tesoura cirúrgica.
- Levantar e corrigir o esterno com uma agulha de calibre 20, abrir a cavidade torácica, e suavemente agarrar o coração com uma pinça anatômicas. Levante o coração e eliminar dos pulmões e vasculatura cortando os vasos da via de saída.
NOTA: Para identificar a aorta, posicione o coração como lado ventral para cima. Isto diminui a distância entre ambas as aurículas, de modo que a aorta, com os seus ramos pode ser encontrado entre os átrios. Dependendo da arquitetura do coração indivíduo, os ramos podem ser removidos se o principal ramo da aorta ainda é longo o suficiente. - Transfira o coração para a placa de Petri de 10 cm contendo refrigerados PBS (veja o passo 2.1.2.1). Canular o coração puxando a aorta ascendente sobre uma cânula de injecção G20x1 ½, que foi atenuada por uma ferramenta multi-oscilatório, para evitar danos nos tecidos. Fixar a aorta com uma rosca sobre a cânula. Lave o coração com PBS para remover o excesso de sangue, empurrando o êmbolo da seringa. Um ligeiro alargamento do coração deve estar visível.
- Langendorff dissociação coração
- Ligue o coração rapidamente canulada para o adaptador de fecho Luer no aparelho de perfusão Langendorff. Perfundir o coração com 30 mL de tampão de perfusão oxigenado a 37 ° C durante 5 min com uma taxa de fluxo de 1 gota / s. ºtaxa de fluxo e pode ser adaptado por regulação do fluxo de O2 no interior do aparelho de Langendorff usando a válvula redutora de pressão (pressão entre 0 e 200 mbar).
- Prepare tampão de digestão imediatamente antes da utilização: tampão de perfusão com 6 U de colagenase B, 10.000 unidades de tripsina, e 50 mM CaCl2. Remover o tampão de perfusão e iniciar a digestão enzimática por adição de 30 mL de tampão de digestão quente (37 ° C) e oxigenado.
NOTA: A quantidade de colagenase B deve ser titulada de acordo com a actividade dos diferentes lotes. - Ajustar o fluxo a uma taxa de 1 gota / s e digerir o coração para 10 - 13 min. Para evitar a contaminação, não use o efluxo novamente. Transferir o coração para uma placa de Petri de 10 cm com 5 ml de tampão de digestão. Dissecar o tecido manualmente com uma pinça, segurando o coração com um par de pinças e utilizando o outro par de rasgar o coração em pedaços pequenos.
NOTA: Nesta etapa, os átrios podem ser separados, cortados em pequenospedaços (com uma tesoura iris), e digerido, durante 30 min em 750 mL de tampão de digestão na incubadora a 37 ° C de modo a obter células isoladas atriais. Para obter cardiomiócitos atriais puros, pipeta para cima e para baixo várias vezes usando uma pipeta de 1 mL. Parar a reacção enzimática através da adição de 750 uL de solução de paragem. - Parar a digestão através da adição de 5 mL de solução de paragem (tampão de perfusão com 5% de FBS e 50? M de CaCl2). Usando uma pipeta serológica, filtrar a suspensão de células através de um coador de células de 100 ^ m e recolher as células num tubo de centrífuga de 50 mL. Centrifugar a suspensão de células filtrada a 80 xg durante 1 min à temperatura ambiente.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento celular em 10 ml de solução de paragem com uma pipeta serológica de 10 mL. Centrifugar a suspensão de células a 80 xg durante 1 min à temperatura ambiente.
- A seguir à centrifugação, desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio de cultura (IMDM com 20% FCS, MM aminoácidos não essenciais 0,1, 50 ug / mL de cada um de penicilina e estreptomicina, e mm β-mercaptoetanol 0,1) para a cultura. Alternativamente, vá para o passo 2.2, "imunofluorescência", e fixar as células.
- Para a fixação em placas de 24 poços, a placa 10,000 de as células isoladas por poço em 8 ug / ml de lamelas revestidas com laminina, em placas de 24 poços com 500 ul de meio de cultura a 37 ° C e 5% de CO 2 durante pelo menos 3 h .
- Preparações dissecadas coração
- imunofluorescência em cardiomiócitos Langendorff-isoladas em suspensão
- Fix cardiomiócitos de Langendorff-isoladas em 1 mL de 4% de PFA em PBS, pH 7,4, durante 15 min à temperatura ambiente. Centrifugar a suspensão de células a 800 xg durante 2 min à temperatura ambiente, remover o fixador, e lavar as células duas vezes com PBS.
- Ressuspender as cardiomiócitos fixos em 1 ml de PBS e, quer prosseguir com a coloração por imunofluorescência ou armazená-los em 500 ul de PBS por poço emuma placa de 24 poços a 4 ° C. Transferir uma parte da suspensão de células (~ 100-200 uL) para um tubo de microcentrífuga. Centrifugar a suspensão de células a 800 xg durante 2 min à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante.
- Permeabilizar, bloco, e corar as células com o anticorpo primário contra α-actinina por adição de 200 uL de anticorpo primário diluído 1: 400 em PBS com 0,2% de Triton X-100 e 5% de soro de burro, durante 1 h à temperatura ambiente.
- Centrifugar a 800 xg durante 2 min à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante. Lava-se a pelete de células com PBS e centrifugar a 800 xg durante 2 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e incubar em 200 uL de anticorpo Alexa-Fluor-secundário conjugado (rato anti-IgG1) diluído 1: 400 em corante Hoechst (solução de trabalho: 1 ug / ml) durante 1 h à temperatura ambiente, protegida da luz.
- Centrifugar a 800 xg durante 2 min à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante. Repita este passo. Proteger a amostra da luz. Resuspend as células em 200-500 ul de PBS e transferir 100-300 uL da suspensão de células a um poço de uma câmara de microscopia. Fechar a tampa da câmara e armazenar as células a 4 ° C até à imagiologia. Proteger da luz.
- Análise da nuclearidade de cardiomiócitos de Langendorff-isolados
- Tome imagens de cardiomiócitos α-manchado-actinina com um objetivo 25X, o que corresponde a uma ampliação de 250X. Contar o número de H2B-MCH + núcleos apenas nos cardiomiócitos que são regularmente manchado por α-actinina e mostram morfologia típica em forma de haste e, portanto, são assumidos para estar intacto.
- Contagem pelo menos 100 cardiomiócitos de três corações diferentes. Calcular as percentagens de mononuclear, binuclear e cardiomiócitos trinucleares.
NOTA: Normalmente, as células binucleares deve fazer-se em torno de 80 - 90%, enquanto as células trinucleares e aqueles com maior número de núcleos são raros (<1% em cardiomiócitos Langendorff-isolados, <3% em fatias de espessura). cardiomiócitos atriais são significativamente menores que os cardiomiócitos ventriculares. Tipicamente, as células mononucleares de fazer-se 90% da população total.
- Isolamento, fixação e criopreservação de corações adultos como preparação para fatias grossas
- Montar um aparelho de perfusão para a fixação, ligando uma seringa de 50 ml a uma torneira de 3 vias com um tubo de extensão Heidelberger e um segundo de 3 vias torneira. Fixar a seringa num suporte de tal forma que o fluxo de passagem é activada por acção da gravidade. Encher o sistema com 15 mL de PBS.
- Siga os passos 2.1.2.1-2.1.2.4, «preparação coração." Ligar a cânula de injecção G20x1 ½ com o coração para o adaptador de fecho Luer do aparelho de perfusão-PBS-cheias sem bolhas e perfundir com PBS. Encher o sistema com 10 - 15 ml de 4% de formaldeído em PBS, o qual é então perfundidos através do coração. Imersão corrigir o coração na solução de formaldeído 4% durante a noite.
- Substitua o formaldeído 4%solução com PBS e lavar o coração em PBS num agitador horizontal a 150 rpm durante 8 h a temperatura ambiente. Trocar a PBS com uma solução de sacarose a 20% para se desidratar o coração durante a noite a 4 ° C.
- Congelar o coração em meio-incorporação crio em um pequeno molde.
- Configurar um copo cheio com 2-metilbutano e colocá-lo em uma caixa com gelo seco. Colocar o coração em um molde congelamento anteriormente meio-cheio com meio de incorporação de crio e cobri-lo completamente com crio a incorporação médio. Com cuidado, coloque o molde no copo frio, evitando o contato do meio-incorporação crio com o 2-metilbutano. Armazenar o tecido congelado a -80 ° C até à sua utilização.
- Preparação das fatias do coração grossas
- Use a seguinte configuração em um Criótomo: uma temperatura objeto de -18 a -20 ° C, a temperatura da câmara de -21 a -23 ° C, um ângulo de compensação no porta-navalha de 4 °, e as lâminas do micrótomo Feather R35.
- Leve o o criopreservadosrgan do recipiente de congelamento e corrigi-lo no disco de amostra com meio-incorporação crio usando a prateleira de congelamento rápido. Posicionar o coração, de tal maneira que o seccionamento começa no vértice.
- Apare fatias de 50 mícrons até que um mesmo plano de corte é alcançada e o órgão se torna visível. Corte de 50 mícrons fatias de tecido utilizando o Criótomo no modo manual com uma velocidade lenta e com a placa de anti-rolo colocados na faca. fatias de montagem em lâminas de microscópio tratados com solução salina. Deixe as fatias de secar durante 30 minutos à temperatura ambiente e armazenar as lâminas a -80 ° C ou mancha directa.
- A coloração das fatias do coração de espessura (núcleos e das membranas celulares)
- Tratar fatias do coração com ARNase A (20 ug / ml) em tampão de lavagem (NaCl 0,5 M, Tris 0,1 M pH 7,5, e EDTA 50 mM) numa cuvete de 1 h a 37 ° C. Incubam-se as fatias em 0,2% de Triton-X, em tampão de lavagem durante 30 minutos à temperatura ambiente. Lavam-se as fatias duas vezes durante 5 minutos cada em tampão de lavagem numa cuvete numaagitador horizontal à temperatura ambiente.
- Mancha durante a noite com 1? M de iodeto de TO-PRO3 (642/661) e aglutinina de germe de trigo acoplada com fluoresceína (WGA, 1: 100) em tampão de lavagem a 4 ° C. Lavam-se as fatias de três vezes durante 5 min cada, com tampão de lavagem em cuvetes num agitador horizontal e cobri-las com meio de montagem de álcool polivinílico com um reagente anti-desbotamento e uma lamela de vidro.
- Aquisição de imagem
- O ideal é usar um microscópio de varredura a laser confocal invertido equipado com um 40X / 1,15 NA objetivo água-dipping. Busca por olho por uma área dentro da fatia que consiste em cardiomiócitos longitudinalmente alinhados; para o efeito, o canal de fluoresceína-WGA (Ex .: 488 nm) é o mais adequado.
NOTA: Este passo é essencial, já que os limites superiores e inferiores dos cardiomiócitos deve ser visível no interior do Z-pilha para análises posteriores. À medida que a profundidade da imagem é limitada a ~ 30 nm, e a espessura da fatia é de 50 um, não é possível imsecções transversais idade destas células (comprimento de células: ~ 120 uM). - Ajustar a configuração dentro do software de imagem. Abra o software de imagem. Abertas A1plus Configurações e marque as caixas para CH2, CH3 e CH4. Definir CH2 para eGFP, Ch3 para Alx546 e CH4 em Alx647 clicando no menu suspenso.
- Para cada canal, clique no HV e configurá-lo para 80, utilizando a barra deslizante. Definir o Offset para 0 usando as barras deslizantes. Clique no botão "Home" para definir o pinhole para a posição inicial. Defina o tamanho de digitalização de 1.024 x 1.024, clicando no menu suspenso e clique em Otimizar para abrir a janela "XYZ Tamanho Setup". Marque a caixa "Perfect Voxel" em "Passo Sugerido (z)".
- Clique em "live scan" e ajustar a intensidade do laser clicando nas barras deslizantes nos canais individuais. Marque a caixa "Z Series" na janela "ND Aquisição" e clique na caixa "definido pelo botão de cima". Definir o topo ebotão do z-stack, clicando nos botões apropriados depois de ajustar o foco no microscópio. Definir a largura z-passo para 0,5 m.
NOTA: A profundidade da Z-pilha é limitada pela penetração óptica no interior do tecido e a relação sinal-ruído. - Vá em "Configurações" A1plus e definir a Linha Média / Integral para 2-4, clicando no menu suspenso. Afinar as intensidades do laser; o orifício deve ser tão pequena quanto possível, a fim de imagem num plano focal.
- O ideal é usar um microscópio de varredura a laser confocal invertido equipado com um 40X / 1,15 NA objetivo água-dipping. Busca por olho por uma área dentro da fatia que consiste em cardiomiócitos longitudinalmente alinhados; para o efeito, o canal de fluoresceína-WGA (Ex .: 488 nm) é o mais adequado.
- Análise de nucleação
- Abra o software de análise de imagem e carregar o z-stack de interesse.
- determinar manualmente nucleação na z-pilhas percorrendo as diferentes camadas da pilha a fim de identificar as células que se encontram totalmente dentro da pilha; este é o caso quando a coloração WGA é visível em todas as dimensões. Contar o número de núcleos (a maioria deles será binuclear) e marcar a célula analisada por uma anotação no software. <li> Determinar o número de núcleos CM (H2B-MCH +) e núcleos totais (TO-PRO3 +) nas reconstruções em 3D para os canais individuais (Figura 2D). No software de imagem, clique em "binário" e escolha "Definir Limiar 3D" no menu suspenso. Escolha do menu de canal suspenso quer Alx546 para o número de núcleos cm ou Alx647 para o número de núcleos totais. Clicando nas setas apropriadas, definir o programa para "4x Smooth", 1x Limpo, e preencher buracos ON. Marque a caixa "Tamanho" e configurá-lo para 5 mm, utilizando a barra deslizante. Definir o limite usando a barra deslizante até objetos separados aparecer.
NOTA: Depois de aplicar a fragmentação, a janela de resultados mostra uma tabela de eventos quantificados e uma fragmentação cor da imagem. Como alguns núcleos contactar directamente entre si, corrigir manualmente o resultado de medição automática para dobletes, que não pode ser corretamente separados pelo software.
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Representative Results
De modo a analisar os efeitos dos siRNAs / miARNs sobre a actividade do ciclo celular de cardiomiócitos pós-natal in vitro, os cardiomiócitos de ratos Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin duplo-transgénicos foram isolados no dia pós-natal 3 (P3) e transfectadas com actividade indutora de miR199 5, p27 siRNA, e siRNA Fzr1 ciclo celular. Em comparação com o controlo negativo (Figura 1A), as imagens de miR199- (Figura 1B) e p27- siRNA (Figura 1C) transfectadas cardiomiócitos mostram uma indução da actividade do ciclo celular. No modelo de rato eGFP-anillin, ARNsi contra Fzr1 podem ser utilizadas como controlos de transfecção, como a inibição da Fzr1 leva à acumulação de proteínas de fusão EGFP-anillin nos núcleos das células transfectadas e uma perda de Fzr1 leva à inibição da APC Fzr1. Fzr1 é um cofactor do complexo ligase E3-promovendo anafase, que tem como alvo anillin para Proteasdegradação omal. A Figura 1D mostra uma vista de imagem confocal de cardiomiócitos siARN Fzr1-transfectadas 3 dias após a transfecção, indicando uma eficiência de transfecção de ~ 45%. Cardiomiócitos que realizam endorreduplicação (por exemplo, após o knockdown de p27 6) mostram expressão eGFP-anillin exclusivamente nuclear (Figura 1E) ou são negativos eGFP-anillin (ver discussão). Eles não expressam eGFP-anillin na fase M-típico localizações (Figura 1F e G), como endorreduplicação apenas consiste de uma fase de endo-S (eGFP-anillin positivo) e uma fase de endo-L (eGFP-anillin negativo ). Na fase de endo-G, a APC é activa, resultando na ubiquitinação e degradação de eGFP-anillin no proteassoma.
Quantificação de porções mono- e binucleadas cardiomiócitos na fase adulta pode ser realizado tanto ao nível de uma única célula após a Landissociação gendorff de Myh6-H2B-MCH corações transgênicos ou cryoslices grossas de corações transgênicos. Após a digestão enzimática do tecido do coração no aparelho de Langendorff, átrios e ventrículos pode ser separada mecanicamente e analisados de forma independente um do outro. A Figura 2A mostra uma imagem representativa de cardiomiócitos ventriculares transgénico H2B-MCH não fixos após isolamento de Langendorff com um elevado grau de cardiomiócitos binucleadas, conforme indicado pela expressão H2B-MCH nuclear. Em contraste, a maioria dos cardiomiócitos atriais estão mononucleadas (Figura 2B). À medida que a digestão enzimática não resulta em células individuais de 100%, o padrão de cruzamento estriamento revelada por coloração α-actinina facilita a discriminação entre cardiomiócitos binucleadas (padrão contínuo de estrias cruzadas, A Figura 2C) e dupletos celulares. A Figura 2D mostra um exemplo da identificação de um dos cardiomiócitos em pelo binucleadasfatia caipira.
reconstruções 3D de rodelas grossas de corações transgénicos Myh6-H2B-MCH adulto pode ser usada para determinar a proporção de núcleos dos cardiomiócitos sob condições fisiológicas no interior do tecido. Usando o módulo de software de imagem 3D, núcleos Hoechst-coradas e núcleos H2B-MCH-positivos podem ser detectadas e contadas automaticamente, tal como ilustrado na Figura 2E. O resultado final deve ser corrigido manualmente para dupletos, o que significa que os núcleos que tocam directamente uns aos outros, no caso em apreço. Para analisar o índice de nucleação de cardiomiócitos em fatias grossas, é necessário para se deslocar manualmente através da pilha, como os núcleos não necessário mentira dentro de um plano z. WGA corante permite a detecção de limites de células.
Figura 1: Exemplos de EmVitro Visualização da actividade do ciclo celular em pós-natais Cardiomyocytes após transfecção com siRNAs. (AD) cardiomiócitos P3 de eGFP-anillin / corações Myh6-H2B-MCH coradas para α-actinina (branco). núcleos de cardiomiócitos são identificados pelo sinal H2B-MCH (vermelho), actividade do ciclo celular por sinais eGFP-anillin (verde), e os núcleos por corante nuclear Hoechst (azul). Cardiomiócitos (A) P3 transfectadas com ARNsi precipitação servir como controlo negativo. O bar é 100 mm. Cardiomiócitos (B) P3 transfectadas com miARN-199 visor significativamente mais sinais eGFP-anillin do que o controlo (A). O bar é 100 mm. (C) Exemplo de sinais eGFP-anillin exclusivamente nuclear após a transfecção com siRNAs p27, indicando a endorreduplicação. O bar é de 80 mm. (D) Transfecção com ARNsi contra Fzr1 para a determinação da eficiência da transfecção. Como AC eGFP-anillinacumula, o número de eGFP-anillin + cardiomiócitos indica a eficiência da transfecção. O bar é de 80 mm. (EG) diferentes localizações de eGFP-anillin (verde) em cardiomiócitos durante o ciclo celular: localização nuclear (seta em E), anel contrátil (setas na F), e localização midbody (seta no G). A barra representa 20 um em (E) e 10 uM de (F e G). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplos para a Avaliação de multinucleações pelo isolamento Langendorff de cardiomiócitos de ratos H2B-MCH e pela análise 3D da grossas fatias. (A, B) ventricular (A) e fibrilação (B) a partir de corações de cardiomiócitos H2 adultoratinhos transgénicos B-MCH após isolamento por dissociação de Langendorff. As barras são de 50 mm. (C) Os cardiomiócitos a partir de corações Myh6-H2B-MCH coradas para α-actinina (verde). núcleos de cardiomiócitos são identificados pelo sinal H2B-MCH (vermelho). O bar é de 10 mm. Cardiomiócitos (D) binucleadas em uma fatia grossa (setas). os núcleos dos cardiomiócitos são identificados pelo sinal H2B-MCH (vermelho), bordas de célula por coloração WGA (verde), e os núcleos por ToPro3 (branco). O bar é 50 mm. (E) de fluxo de trabalho para a análise 3D da binucleação em fatias grossas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Há uma controvérsia sobre se os cardiomiócitos são capazes de reentrar no ciclo celular e dividir após a lesão e durante a homeostase do tecido. Os valores para o volume de base de cardiomiócitos foram dadas no intervalo entre 1% e 1 80% 7. Também após uma lesão cardíaca, a indução da actividade do ciclo celular e a geração de novos cardiomiócitos tem sido relatado na zona de fronteira, com valores entre 0,0083% 8 e 25 - 40% 7. Estas discrepâncias podem ser parcialmente explicadas por diferentes abordagens experimentais para identificar núcleos cardíacos, um processo que é muito desafiador em cortes histológicos 9 e durante a divisão celular. Como cardiomiócitos são propensos a variações do ciclo celular, é de importância crucial para a divisão celular distinguir autêntica de endorreduplicação e mitose acytokinetic, que levam a células poliplóides e multinucleadas. Paraa identificação da divisão celular, que é necessário para visualizar imagem de marca da divisão celular, tais como anéis contrácteis e midbodies, bem como para determinar a percentagem de cardiomiócitos binucleadas. Nós desenvolvemos técnicas para analisar a actividade do ciclo celular em cardiomiócitos em detalhe e para determinar o seu grau de nuclearidade em células isoladas ou em secções espessas.
É importante notar que o sistema de eGFP-anillin fornece prova directa da divisão celular, por meio da visualização de um anel simétrico contráctil (Figura 1F) e a secção central (Figura 1G), ea prova indirecta para endorreduplicação e mitose acytokinetic. Como descrito anteriormente, a ocorrência de uma ingressão unilateral do anel contráctil é um indicador de binucleação 10, e isto pode ser observado com o sistema de eGFP-anillin.
Endorreduplicação é sugerido desde que nenhum anel contrátil ou midbody são observados, o que torna os cálculos das probabilidades de detectar estas localizações obrigatório. Assumindo que uma duração do ciclo celular de 25 h, uma duração média de visibilidade anel contráctil de 20 min, e uma secção central persistência de 1 h, deve haver um anel contráctil em 100 células em divisão eGFP-anillin-positivos e 4 midbodies. Estatisticamente, teriam de ser analisados para distinguir a divisão celular de variações no ciclo celular de células de um mínimo de 25 eGFP-anillin-positivos. Esse número muda de acordo com a duração do ciclo celular (que é muitas vezes desconhecida) aumenta ou diminui. Isto também implica que a maioria dos sinais eGFP-anillin será nuclear (Figura 1E), como fase M, a única fase com localizações não nucleares, dura apenas cerca de 1 h.
Durante o desenvolvimento pós-natal, binucleação ocorre em corações de rato e aumenta para 90% em cardiomiócitos ventriculares (~ 25% em seres humanos) 11. for a análise de regeneração no coração, é importante para determinar o grau de binucleação. Nós descrevemos dois métodos para lidar com esta característica morfológica importante: a saber, Langendorff dissociação e a criação de seções espessas de tecido cardíaco. Embora o isolamento de Langendorff é mais fácil e mais rápido, a morfologia das secções espessas é mais demorada, mas também mais preciso. Curiosamente, verificou-se que o isolamento de Langendorff sobrestima a percentagem de cardiomiócitos binucleares. Isto pode ser devido a diferentes taxas de sobrevivência de células mononucleares e binucleares durante este procedimento bastante rígida.
Como a indução de proliferação em cardiomiócitos pós-natais é uma abordagem emergente na regeneração cardíaca, este protocolo descreve um sistema de rastreio por combinação de duas linhas de ratinhos transgénicos, Myh6-H2BmCh e CAG-eGFP-anillin. Cardiomiócitos isolados de corações no pós-parto dias P1 - P6 podem ser facilmente cultivadas e transfectadas com miRNAs ousiRNAs ou tratados com as bibliotecas de moléculas pequenas. núcleos de cardiomiócitos podem ser manualmente ou automaticamente detectado por algoritmos de software, e potenciais "hits" pode ser determinado por um aumento no número de núcleos + MCH. Discriminação de divisão celular de endorreduplicação e mitose acytokinetic pode ser feito por quantificação das diferentes localizações dos sinais eGFP-anillin. Este sistema deverá lançar alguma luz sobre os mecanismos regulatórios pós-natal proliferação de cardiomiócitos subjacente e podem conduzir à descoberta de novos agentes terapêuticos para o tratamento de doenças cardíacas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri dish | Sarstedt | 821472 | |
| 100 µm cell strainer | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 352360 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| G20x1 ½ injection cannula, Sterican | Braun, Melsungen | 4657519 | |
| 20 gauge needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | |
| 24-well plates | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 353047 | |
| 2-Methyl-butane | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3927.1 | |
| 37% formaldehyde solution | AppliChem GmbH | A0936,1000 | |
| 3-way stopcock | B. Braun Medical Inc. | 16494C | |
| 50 mL syringe | B. Braun Medical Inc. | 8728810F | |
| 70% ethanol | Otto Fischar GmbH | 27669 | |
| Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-605-205 | |
| Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG | Sigma-Aldrich, Steinheim | A7811 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area | Greiner bio-one | 675986 | |
| Collagenase B | Roche | 11088815001 | |
| confocal microscope Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| cryostat CM 3050S | Leica | ||
| donkey serum | Jackson Immuno Research, Suffolk, GB | 017-000-121 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| fetal calf serum | PromoCell, Heidelberg | ||
| Formaldehyde solution (4%) | PanReac AppliChem | A3697 | |
| Gelatine from porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich, Steinheim | G2500 | |
| glass coverslips | VWR | 631-0146 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Heidelberger extension tube | IMPROMEDIFORM GmbH | MF 1833 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 5394.02.00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HistoBond microscope slides | Marienfeld | 0810000 | |
| Hoechst 33342 (1 mg/mL) | Sigma Aldrich, Taufkirchen | B2261 | |
| Insulin syringe | Becton Dickinson GmbH | 300334 | |
| Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 21980-032 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | Corning | 354221 | |
| Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti | Nikoninstruments, Düsseldorf | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | 13778075 | |
| Mouse IgG Cy5 (donkey) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| microcentrifuge tube | Sarstedt | 72690 | |
| Mini shaker | VWR | 12620-940 | |
| mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4464066 | |
| Biopsy Mold | Sakura Finetek/ VWR | 4565 | |
| M-slide 8-well ibiTreat | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Merck Millipore | 567530 | |
| negative control(scrambled RNA) | Ambion/Thermo Fischer Scientific | AM4611 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach | 130-098-373 | |
| NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit | Nikoninstruments, Düsseldorf | ||
| Non essential amino acids, NEAA | Gibco/Life Technologies, Darmstad | 11140-035 | |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco | 51985-026 | |
| P21-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| P27-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Steinheim | 14190-094 | |
| Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading | Sigma-Aldrich | 10981 | |
| RNase A | Qiagen | 1007885 | |
| RNaseZap | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | AM9780 | |
| sample containers | Vitlab | 80731 | |
| Serological pipette | Greiner | 607180 | |
| software NIS Elements | Nikon | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek/ VWR | 25608-930 | |
| ToPro3 iodide (642/661) | Molecular probes/ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X | Fluka | 93418 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93418 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeled | Vector Laboratories | VEC-FL-1021-5 | |
| α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Steinheim | M3148 |
References
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